[发明专利]用病毒抗原表达特异性免疫原

说明书

本发明涉及流感病毒血凝素（HA）嵌合蛋白，这些蛋白可以用作抗病毒、抗病原菌或抗其它对癌组织、变态反应等具有特异性的抗原的疫苗，这些嵌合蛋白还可以用于这类抗原所致症状的治疗和这类抗原或相关抗体的检测。本发明还提供了编码这类蛋白质的核苷酸顺序。

外源性抗原决定簇，如人类免疫缺陷病毒抗原决定簇，被插入到HA蛋白的抗原性位点，这些嵌合蛋白就能够诱导针对所插入的抗原决定簇的特异性免疫反应。

有许多手段用于制备疫苗。对病毒性疾病而言，这些方法包括应用灭活病毒、活病毒、活重组病毒、病毒蛋白、病毒亚单位蛋白等。

但是，许多类型的疫苗只取得了有限的成功，其部分原因在于生物体的株系或分离物之间彼此有广泛的遗传变异。此外，参与发病机理的人或动物抗原，即参与变态反应的IgE、肿瘤抗原等，在产生这些抗原的同种动物体内并不诱发有益的免疫反应，这些抗原实际上被作为自身蛋白而不是抗原来对待。

然而，希望用具有给定抗原的生物学功能的小的肽顺序或抗原决定簇作免疫原，即使在同源动物中也是如此。从理论上讲，当这些肽被注射到动物体内后，就能用于诱导免疫反应。但实际上，这些肽常常并不是良好的免疫原，因为它们一般都很小，不能使自身有利地呈递给免疫系统。

人免疫缺陷病毒（HIV）的外被膜糖蛋白（gp120）第二保守区，就是这类弱免疫原性肽的例子。已发现该区域对于HIV的感染性和抗体中和作用是很重要的（Science，1988年2月26日，p1021）。针对该区域（氨基酸254-274）的抗血清可以在体外中和三种不同的HIV分离物，而不影响病毒与T细胞受体或CD4阳性细胞的结合。据信，该保守区在病毒穿入过程中的后结合作用中很关键，因而可能是抗体中和作用的潜在靶体。但是，已经观察到，在天然的HIV感染过程中，当该区域被呈递给免疫系统时，它相对地处于“免疫静止”（immunosilent）状态。这种免疫静止现象提示，该抗原决定簇可能由于（例如）蛋白质的构型而被遮掩。

有关HIV抗原进一步的详细情况可参见下列文献：Rusche等，“抑制人免疫缺陷病毒感染细胞融合的抗体与病毒被膜gp120结合”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：3198-3202，1988年5月;Bolognesi，“抗SIV和HIV疫苗研制进展”，Journal  of  Acquired  Immune  Deficiency  Syndromes，3：390-394，Raven  Press，Ltd，New  York，1990;Wain-Hobson，“艾滋病毒LAV的核苷酸顺序”，Cell，40：9-17，1985年1月;Ho等，“gp120的第二保守区对HIV的感染性和抗体中和作用起重要作用”，Science，239：1021-1023，1988年2月26日。

增强抗原决定簇肽免疫原性的一个途径是通过以某种方式将它们与融合蛋白、大分子或佐剂相连接，增大它们的体积，从而增强其识别能力。

Colbere-Garapin等人报道了Ⅲ型脊髓灰质炎病毒插入突变株（萨宾株）的制备，其中，将额外的氨基酸顺序（三肽或六肽）插入到衣壳蛋白VP1的中和位点1中（Colbere-Garapin等，“在脊髓灰质炎病毒的主要衣壳蛋白中加入外源性寡肽”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：8668-8672，1989年11月）。

Evans等人报道了含有Ⅰ型人免疫缺陷病毒（HIV-1）跨膜糖蛋白（gp  41）的抗原决定簇的脊髓灰质炎病毒抗原性嵌合蛋白的构建和鉴定。通过皮下注射活的脊髓灰质炎病毒/HIV嵌合体得到的兔抗血清显示出对多种美洲和非洲HIV-1分离物具有广泛的中和作用（Evans等，“一种经过改造的脊髓灰质炎病毒嵌合体能诱导出具有广泛反应性的HIV-1中和抗体”，Nature，339：385-388，1989年6月1日）。但是，利用活的病毒载体，例如脊髓灰质炎病毒，会产生实际应用的问题，因为血清抗体可能会抑制重组病毒在机体中的复制。此外，活的病毒载体对插入片段的大小有严格限制，因而所提供的插入位点的数目有限。