[发明专利]酶促生成的二羟乙酸/氨甲基膦酸混合物的氢化方法

说明书

本发明是关于由在含有氨甲基膦酸（AMPA）和甘醇酸酯氧化酶（（S）-2-羟基-酸氧化酶，EC1.1.3.15）及过氧化氢酶（EC1.11.1.6）的水溶液中乙醇酸和氧气反应生成的混合物氢化制备N-（膦酰基甲基）甘氨酸的方法。N-（膦酰基甲基）甘氨酸是一种可用于控制多种植物生长的广谱苗后除草剂。

甘醇酸酯氧化酶，一种通常存在于多叶绿色植物和哺乳动物细胞中的酶，它能催化乙醇酸氧化成二羟乙酸并在氧化过程中有附随物质过氧化氢生成：

N.E.Tolbert等人，在J.Biol.Chem.，Vol，181，905-914（1949）中首次报道了一种从烟草叶中萃取得到的酶，它能催化氧化乙醇酸其中经过中间产物二羟乙酸的生成而最终制得甲酸和CO₂。某些化合物的加入，例如乙二胺的加入限制了中间产物二羟乙酸的进一步氧化。氧化反应是在pH值约为8的条件下进行，典型的乙醇酸所用的浓度为约3-40mM（毫摩尔）。优选的用于甘醇酸酯氧化反应的pH值据报道应为8.9。草酸（100mM）可用来抑制甘醇酸酯氧化酶的催化作用。同样，K.E.Richardson和N.E.Tolbert，在J.Biol.Chem.，Vol.236，1280-1284（1961）中揭示了含有三（羟基甲基）氨基甲烷（TRIS）的缓冲剂抑制草酸在乙醇酸的甘醇酸酯氧化酶催化氧化过程中的生成。C.O.Clagett，N.E.Tolbert和R.H.Burris，在J.Biol.Chem.，Vol.178.977-987（1949）中报道了用于乙醇酸和氧气的甘醇酸酯氧化酶催化氧化方法中优选的pH值为7.8-8.6，优选的温度为35-40℃。

I.Zelitch和S.Ochoa，在J.Biol.Chem.，Vol.201，707-718（1953）中和J.C，Robinson等人在J.Biol.Chem.，Vol.237，2001-2009（1962）中报道了在菠菜甘醇酸酯氧化酶催化氧化乙醇酸的过程中由于H₂O₂与二羟乙酸的非酶反应生成了甲酸和CO₂。他们观察到了过氧化氢酶即催化H₂O₂分解的酶的加入由于其抑制了甲酸和CO₂的生成从而极大地提高了二羟乙酸的收率。FMN（黄素单核苷酸）的加入还极大地增进了甘醇酸酯氧化酶的稳定性。

N.A.Frigerio和H.A.Harbury，在J.Biol.Chem.，Vol.231，135-157（1958）中报道了从菠菜中分离得到的乙醇酸氧化酶的制备方法和性质。已经发现纯化的酶在溶液中非常不稳定，这种不稳定性归因于黄素单核苷酸（FMN）对于酶活性位置相当微弱的结合和酶的酶活性四聚物和/或八聚物离解成酶钝化的单体和二聚物，也就是发生了可逆的聚集和沉淀，FMN（黄素单核苷酸）加入到酶溶液中将会极大地增加其稳定性，另外，高蛋白浓度或高的离子强度也能使酶维持于四聚物或八聚物。

另外还有其它众多的参考文献涉及用乙醇酸氧化酶催化乙醇酸氧化的方法。下列参考文献中描述了酶的分离方法（和分析方法）：I.Zelitch，的Methods    in    Enzymology，Vol.1，Academic，Pre-ss，New    York，1955，P.528-532（从菠菜和烟草叶中），M.Nishimura等人，在Arch.Biochem，Biophys，Vol.222，397-402（1983）中（从南瓜Cotyledons），H.Asker和D.Davies，Biochim.Biophys.Acta，Vol.761，103-108（1983）（从鼠肝脏中），和M.J.Emes和K.H.Erismann，在Int.J.Biochem.Vol.16，1373-1378（1984）中Lemna    minor    L中）对酶的结构同样也有报道如：E.Cederlund等人在Eur，J，Biochem.，Vol.173，523-530（1988）中和Y.Lindquist和C.Branden，J.Biol，Chem.Vol.264.3624-3628（1989）。