[发明专利]甲型肝炎疫苗的生产方法

说明书

本发明涉及甲型肝炎疫苗，特别是涉及制备甲型肝炎L-A-1减毒病毒株和以该病毒株为毒种生产甲型肝炎疫苗的方法，以及该疫苗在预防甲型肝炎病毒感染中的应用。

甲型肝炎是一种由自然界广泛存在的甲型肝炎病毒（HAV）引起的全球性传染病，全世界约有40亿人口受到该疾病的威胁。在包括中国在内的发展中国家，由于人口众多、社会经济落后及卫生条件低下等原因，时有甲型肝炎的大规模暴发或局部流行。在经济发达的美国，每年也有高达10，000例肝炎病人与此类病毒感染有关，甲型肝炎的发病率占临床肝炎总病例数的15～20%。据粗估计，在中国有近5亿人口受到甲型肝炎的威胁，每10万人口中约有200～300人遭受感染。上海市1983年和1988年两次甲型肝炎大流行，给当地人民的健康和国民经济发展带来严重损害，对此，至今人们仍然心有余悸。面对这样的现实，迫切要求发展有高特异性和安全的、可适于临床应用的甲型肝炎疫苗，对易感人群进行大规模免疫接种，以大幅度降低甲型肝炎发病率并有效地控制其暴发性流行。

七十年代中期以来，许多研究者致力于甲型肝炎减毒活疫苗或灭活疫苗的研究。如美国专利4，164，566号公开了在亚人类灵长目动物（如狨猴）细胞培养物中连续传代选育甲型肝炎病毒，并以其所得到的甲型肝炎病毒CR326病毒株在多种细胞系内传代增殖制备甲型肝炎疫苗的方法。美国专利4，532，215号和4，636，469号中公开了从甲型肝炎病人粪便中至少经5次传代以制备甲型肝炎HM-175病毒株的方法。美国专利，4，506，016号公开了使甲肝病毒首先适应于人肾细胞，然后再适应于人肺纤维母细胞，以制备可用作疫苗之减毒甲肝病毒的方法。上述这些现存技术虽然分别建立了不同的方法学并分离纯化了不同的甲型肝炎减毒病毒株，但他们几乎都只是限于动物试验和小数目人体试验阶段，而且所获得病毒株的免疫接种效果、和诱导动物抗体生成的能力远不能令人满意（如参见P.L.Provost    et    al.，J.of    Med.Vivol.20：165-175，1986和K.Midthun    et    al.，J.of    Inf·Dis·163：735-739，1991）。

中国专利申请85107525号公开了一株新的甲型肝炎H₂减毒病毒株及其纯化和减毒方法，但他们使用的病毒株与我们的不同，而且病毒株的分离条件和纯化方法也有所差异，特别是该专利申请并没有详细描述以所说的种子病毒株工业化生产甲型肝炎疫苗的方法。

本发明的一个目的是提供一种制备甲型肝炎减毒活病毒株的方法，该方法包括制备甲型肝炎急性期病人粪便样品的悬浮液，以此病毒悬浮液感染人二倍体细胞，达到病毒增殖高峰后分离细胞提取物，并以该提取物作为种子病毒来源用同一细胞基质进行连续传代减毒。

本发明的另一个目的是提供一株以上述方法制备的甲型肝炎减毒活疫苗L-A-1病毒株，该病毒株已于1992年12月21日保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），其保藏登记号为CCTCC    NoV92004

本发明的再一个重要的和更具实际意义的目的是提供一种以L-A-1甲型肝炎减毒病毒株为毒种，大规模工业化生产甲型肝炎疫苗的方法，该方 法包括用旋转培养法，培养人胚肺二倍体细胞并用Eagle氏液洗细胞，然后直接接种L-A-1减毒病毒株，培养约4周后换成作为疫苗的199综合培养液并继续于35-36℃下培养。

根据本发明，首先直接利用人二倍体细胞从甲型肝炎急性期病人粪便样品中分离甲型肝炎病毒颗粒，然后于低温条件下采用同一细胞基质连续传代，以得到本发明的甲型肝炎减毒活疫苗L-A-1病毒株。将该疫苗病毒株加到人胚肺二倍体细胞培养物中旋转培养，可大规模工业化生产甲型肝炎疫苗。

现对制备本发明甲型肝炎减毒活病毒株和以该L-A-1甲型肝炎减毒病毒株为毒种生产甲型肝炎疫苗的方法详细描述如下。

I.甲型肝炎L-A-1病毒株的制备

1.病毒接种物的制备

采集甲型肝炎急性期病人的粪便标本，用无牛血清Eagle氏基本培养液（MEM）制成5%（V/V）悬浮液。该悬浮液经高速离心后，取上清液通过200nm滤膜除菌过滤。所得滤液经常规血清学方法和免疫电镜观察，证实其中含有27-32nm大小的HAV颗粒，此即为病毒接种物（参见胡孟冬等，上海医学，1988，11∶653-656）。

2.病毒的分离和纯化