[发明专利]白介素6-白介素2融合蛋白及其制法和用途

说明书

本发明涉及一种具有功能蛋白的白介素6（IL-6）-白介素2（IL-2）融合蛋白及其制法和用途，特别涉及具有免疫调节抗癌、淋巴瘤等功能的白介素6-白介素2融合蛋白及采用生物高技术制备方法。

以往研究表明：IL-2是由T细胞分泌的一种细胞因子，具有广泛的免疫活性，临床应用可使25-30%的淋巴瘤、肾癌、黑色素瘤病员达到治愈或有效。结肠癌及非何杰金氏淋巴病也有较好疗效，而且可增强免疫力，提高抗B型肝炎病毒免疫力。IL-6是继IL-2等细胞因子后又一具有明显抗癌活性的生物免疫调节剂，属参与造血、免疫的多功能因子，其特点为抗肿瘤活性高，毒性作用小。新近实验证实，IL-6可诱导的LAK活性也可直接作用于杀伤细胞，促进其功能分化。[Carman RD.etal.Proc，Natl.Acad.Sci.USA，1987;84：7629][Okada Metal，J.Inol，1988;141：1543]这些都是IL-2、IL-6单因子在某些领域的研究，目前尚未见具有IL-2-IL-6融合蛋白的报道。

本发明的目的是提供一种白介素6-白介素2融合蛋白。

本发明的另一目的是提供一种采用生物高技术来制备白介素 6-白介素2融合蛋白的制备方法。

本发明的又一目的是提供采用白介素6-白介素2融合蛋白作为高效的抗癌药物。

本发明的目的是通过下述的方法实现的。

我们通过优化转译起始序列，合成IL-6功能区上、下游引物，中间接头一对寡核苷酸，IL-2下游引物，将天然终止密码子TAG换成大肠杆菌偏性密码子TAA，PCR扩增获得IL-6，IL-2功能区片段，经纯化后酶切，连接重组至表达载体PBV220，诱导表达、分离纯化包涵体，变性复性获得具有IL-2、IL-6双活性融合蛋白。

IL-6-IL-2融合蛋白较IL-6、IL-2单因子或双因子联合有更多生物学效应。

图1为IL-6-IL-2融合蛋白DNA序列图，碱基（bp）。

图2为融合蛋白表达载体构造图。其中1是PUC19-IL2.2是PBV220，3是PBV-IL2，4是PUC19-IL6，5是PBV-IL6IL2，6是IL2基因片段，7是ILC基因片段。

下面结合附图对本实施例作详细说明。

图1，IL-6-IL-2融合蛋白由IL-6序列（DNA序列1-540bpl中间接头（DNA序列541-585bp）IL-2序列（586-990bp）接头15-45bp不等，可由甘、苏、丙、丝及天门冬酰胺组成，IL-2，IL -6指与天然因子实质上一致，可与相应配基结合，转导生物信息引起生物活性，并可与相应抗体进行反应。

一、IL-6功能区基因克隆。

利用Seqnce程序通过计算机分析确定转译的最佳起始区域，使其具有最小自由能，最佳碱基排列，避免可能干扰转译起始的aRNA二级结构;确保两个引物之间，引物与模板之间具有最少的配对以避免扩增不必要的序列;在上游和下游引物中分别导入EcoRI和NdeI酶切位点加入起始密码子ATG。deI酶切位点是将IL-63’末端CAA ATG突变为CAT ATG而致。人工合成寡核苷酸引物：左侧（上游）引物5’CCG AAT TC ATG CAACAT TCC AAA CAT3’，右侧（下游）引物5’TAC ATA TCC CGA AGA GCC CTC3’。以IL-6 cdna为模板，PCR扩增IL-6基因片段，获得约540bp产物，将上述片段经蛋白酶K消化处理后、酚/氯仿、乙醇沉淀萃取DNA经EcoRI酶切后与PUC19载体EcoRI，SmaI双酶切后重组，转化JN101受体菌，筛选白斑菌落，酶切鉴定获得阳性克隆PUC19-IL6。

二、中间接头与IL-2功能区基因克隆。