[发明专利]抗肿瘤的脑啡肽-干扰素融合蛋白及其制法

说明书

本发明涉及一种新型、高效的抗肿瘤的脑啡肽-干扰素融合蛋白及其制法，特别涉及在大肠杆菌中表达的重组脑啡肽-干扰素融合蛋白及其制法。

在现有技术中，已知干扰素是一种具有抗肿瘤、抗病毒和免疫调节等多种生物学功能的细胞因子，近年来已开始应用于治疗肿瘤病、病毒病和免疫性疾患。但是现有的干扰素产品均不具有专一针对肿瘤细胞的特异性，因而在实用中仍表现出有效剂量大、不同程度地损害正常细胞、以及存在相当程度的不良副反应等缺点。

本发明的目的在于提供一种将干扰素专一导向肿瘤细胞，不会损害正常细胞，即副作用很小、有效剂量小的具有抗肿瘤、抗病毒和免疫调节等多种生物学功能的脑啡肽-干扰素融合蛋白。本发明的另一目的是提供一种脑啡肽-干扰素融合蛋白的制备方法。

本发明是这样来实施的：

（1）组成方面：

是脑啡肽-干扰素融合蛋白，它是氨基端的脑啡肽5肽部分（Try-Gly-Gly-Phe-Met）和羧基端的干扰素166肽部分，两者由中间连接肽3肽（Ser-Gly-Ser）相连，总分子量为21kD。这种融合蛋白的脑啡肽部分负责与肿瘤细胞表面所富含的脑啡肽受体结合，即发挥导向功能，而其中的干扰素部分则负责发挥抗肿瘤细胞生长的功能，而中间连接肽的存在，保证了上述两个生物大分子能独立形成各自的立体构象，从而保证两者均能最大限度地发挥出各自的生理功能，成为一种“生物导弹”。

（2）制法方面，共分6个步骤：

（ⅰ）脑啡肽基因和连接肽基因的合成：是在通用的DNA自动合成仪（美国Applied    Biosystem公司381A型）上采用已知的亚磷酰胺法化学合成。合成片段的结构设计为TCGACATGTACGGTGGCTTTATGTCCGGATCCTGCGACCTGC，其中已包括脑啡肽和连接肽的编码区。

（ⅱ）IFN基因的分离：是采用冷冻匀浆及蛋白酶，从人的胎肝中提取染色体DNA作为模板进行常规的聚合酶链式反应，扩增出人的干扰素-α1c基因。

（ⅲ）连接：用限制性内切酶Ddel切割干扰素-α1c基因产生粘端，与合成基因部分经T4    DNA连接酶连接成融合基因。随后将融合基因经连接酶催化连接组装入原核表达质粒pBV220中，经DNA测序证明与设计相符。

（ⅳ）表达：融合基因在pBV220中由PRPL串联启动子控制在大肠杆菌中表达重组蛋白，即脑啡肽-干扰素融合蛋白。

（ⅴ）纯化：表达的重组脑啡肽-干扰素融合蛋白经抗α1型干扰素单克隆抗体亲和层析纯化后，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳呈单一条带。氨基酸序列测定结果表明，融合蛋白N端15个残基序列与原设计完全符合。

下面的优选例对本发明的脑啡肽-干扰素融合蛋白及其制法作详细说明，但不限制本发明的范围。

脑啡肽-干扰素融合蛋白的基本构成是氨基端的脑啡肽部分（Try-Gly-Gly-Phe-Met）和羧基端的干扰素166肽部分，两者由中间连接肽3肽（Ser-Gly-Ser）相连，总分子量为21kD。

制造方法的例子是：

（ⅰ）脑啡肽基因和连接肽基因的合成：是在通用的DNA自动合成仪（美国Applied    Biosystem公司381A型）上采用已知的亚磷酰胺法化学合成两条互补单链，单链1的序列为TCGACATGTACGGTGGCTTTATGTCCGGATCCTGCGACCTGC，单链2的序列GTACATGCCACCGAAATACAGGCCTAGGACGCGGACGGACT，两片段退火后构成包括脑啡肽和连接肽的编码区的双链。各1微克的两条互补单链在以下条件退火：pH＝7.5、室温和采用0.05mol/L三羟甲基氨基甲烷/盐酸退火缓冲液。

（ⅱ）干扰素基因的分离：是采用冷冻匀浆及蛋白酶从中国人的胎肝中提取染色体DNA，再经苯酚和氯仿纯化后的DNA作为模板，再用常规通用的聚合酶链式反应扩增出人的干扰素-α1c基因，随后连接到通用的质粒pUC18中建成无性繁殖系。

（ⅲ）连接：用限制性内切酶DdeI切割干扰素基因，产生Ddel粘端，与合成并经退火形成的双链的DdeI粘端在T4    DNA连接酶催化下连接，最终构成编码融合蛋白的基因片段。将该基因片段再经T4    DNA连接酶催化连接后组装入原核表达质粒pBV220中，经DNA测序证明与设计相符。