[发明专利]神经生长因子的制备方法

说明书

本发明涉及一种医学上使用的神经生长因子的制备方法。

神经生长因子(Never Growth Factor缩写为NGF，以下同)是1986年获诺贝尔医学奖的新发现，它的发现是神经生物学的一场革命，现已基本阐明NGF的生物活性和生理功能以及与某些神经系统疾病的关系、神经生长因子的发现者Rlta Lovl说，该因子很可能是神经系统、免疫系统和内分泌系统三大系统中的中心调节因子，若其这样，将会使许多疑难疾病的病因得到恰当解释，给这些病带来治愈的希望，所以目前许多国家都在设法制取该因子，以造福于人类，美国已进入II期临床阶段，年销售量达10亿美元。但国外制取神经生长因子多是从小鼠颌下腺提取，为异种蛋白，临床应用有不良反应，而且所用设备工艺复杂，周期长，产品价格昂贵，难于推广应用。

本发明的目的就是针对神经生长因子的重要性，提供一种易于制取，易于推广应用的，从人胎脑组织提取为同类蛋白来制备神经生长因子的新方法，以造福于人类。1

本发明的目的是这样来实现的，在无菌操作下，取水囊引产的正常胎儿脑皮、脑黑质、颌下腺等组织，通过冻融、高速离心、萃取等一系列精制过程，再除菌后制成。

该工艺方法制成的神经生长因子价格低，疗效好，其生产方法简单，所需设备价格低，很易于推广应用。

以下结合实施例对本发明作详细说明。

1)工作人员的要求：参与本发明的工作人员，必须身体健康，无传染病，并定期进行体格检查，主要负责制备和质量检定的人员必须经过严格无菌操作训练，并掌握本项工作的基本知识和操作技术。所有人员应相对稳定或固定。

2)无菌室设备要求：无菌室应按卫生部生物制品规定要求建立GMP标准的百级生物净化工作间。若是普通无菌室应有一定的面积和高度(2.4米)。室内安装紫外光灯、并有层流净化台。制备室至少每月用乳酸加热生成蒸气进行空气消毒一次。地面和工作台面经常用1‰的新洁尔灭或2％的来苏液擦拭。玻璃用70％的酒精擦拭。制备间每次使用前应开紫外灯30分钟以上。室内定期做细菌培养，并记录结果。无菌室内各种用具应固定、专用。

3)设备及用具要求：一切与制品接触的用具器皿均应用无菌无热原的双蒸水冲洗。用前均应有适宜的方法进行消毒及除热原处理。

所用所有试剂均应符合中华人民共和国药典或化学纯的要求，并用不含热原的蒸馏水制备。

4)原料要求：用于制备NGF的原料应是母体健康无传染性疾病，胎儿发育正常，无畸形，合法水囊引产的5-8个月龄的胎儿。从胎儿娩出到送至制备场所不得大于8小时，并且是无菌低温(室温以下)运送。立即无菌解剖出脑黑质和颌下腺等组织。-20℃温度保存不得超过3个月。

5)制备操作工艺：

1.取合法水囊引产的正常胎儿脑组织等，除去包膜和大血管冲去血迹。2.用高速捣碎机或超声粉碎器，把脑组织捣碎制成匀浆。3.在-25℃温度下快速冻结与30℃温度下快速融化，反复快速冻化三次到显微镜下查不到完整细胞。4.70℃水浴1.5-2小时，4000转/分离心，20分钟，得上清。5.上清液用3.67％浓度的HCl调至pH至3.5，置4-12小时，以除去杂蛋白及清除病毒。6.4000转份离心20分钟，取一清。7.把一清用8％浓度的NaHCO₃调pH至7.0-7.2后立即除菌正压超微抽滤，除菌滤膜为孔经2.2μ以下。8.以上处理产品，经检查合格后，可分装安瓶备用。必要时可制成冻干粉剂型。

6)成品质量要求及检定

①本品外观是无色澄明液体，无异物或摇不散的沉淀物。

②无菌试验，按卫生部生物制品无菌试验规程进行，细菌及霉菌培养结果都是阴性。H_BSAg测用敏感性为3ng/ml以下的试剂检测为阴性。

③热原试验：按中华人民共和国药典关于《生物制品热原试验规程》进行。注射剂量按家兔体重注射3ml/kg判断标准按静脉注射判定。

④安全试验：豚鼠试验：取体重300-400g豚鼠2只，每只腹腔注射待检品5ml，观察7天，动物健在，体重增加为合格。如不符合上述在要求，应用4只豚鼠复试一次，判断标准同前。

小白鼠试验，取体重18-20g小白鼠5只，每只从尾静脉或腹腔注射待检品0.5ml，半小时内动物不应有有异常，继续观察7天，动物健在为合格。不合适可用10只小白鼠复试判定标准同前。

⑤化学检定，按生物制品化学检定规程进行

1)pH值应为7.0-7.2；

2)紫外光吸收度，在280nm波长，吸收值大于0.5；