[发明专利]肿瘤坏死因子突变蛋白

说明书

肿瘤坏死因子，更具体地说，肿瘤坏死因子α(TNF-α)，是一种主要由受刺激的巨噬细胞产生的细胞素，它不仅对各种肿瘤细胞显示出显著的细胞毒性(Carswell等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA72：3666-3670，1975)，而且在炎症和免疫反应中起多种介导物的作用(综述见Beutler和Cerami，Ann.Rev.Immunol.7：625-655，1989；Bonavista和Granger编“肿瘤坏死因子：结构、作用机理、以及在疾病和治疗中的作用”，Karger，Basel，1990)。已经从大肠杆菌中克隆和表达的cDNA的核苷酸顺序，推导出了人肿瘤坏死因子α-(hTNF-α)的一级结构(Pennica等，Nature312：724-729，1984；Marmenout等，Europ.J.Biochem.152：515-522，1985；Wang等，Science228：149-154，1985；Shirai等，Nature313：803-806，1985)。已发现hTNF-α和人淋巴细胞毒素的氨基酸顺序有显著的同源性(30％)。人淋巴细胞毒素常被称作人肿瘤死因子β(hTNF-β)，是一种主要由淋巴细胞产生的细胞素(Gray等，Nature 312：721-724，1984；Fiefs等，Cold Spring HarbourSymp.51：587-595，1986)。

本领域内还曾描述了氨基酸顺序经过修饰的hTNF-α，即所谓的TNF-α突变蛋白(例如见Yamagishi等，Protein Engineering3：713-719，1990；或Fiers在Aggarwal和Vilcek编的“肿瘤坏死因子：结构、功能和作用机理”一书中的文章，Marcel Dekker，Inc.，New York，印刷中；或Fiers等人在Bonavista和Granger编的书中第77-81页的文章(同上))。此外，TNF-α突变蛋白也曾是许多专利申请的主题，例如国际专利申请公开WO 86/02381、WO 86/04606、WO 88/06625；欧洲专利申请公开155,549；158,286；168,214；251,037和340,333；以及德国公开说明书3843534。

本领域中还曾公开了淋巴细胞毒素的突变蛋白，例如见欧洲专利申请公开250,000；314094和336,383。

TNF的生物学效应是通过两种特异性受体介导的，一种受体经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定的表观分子量为55kD(p55-TNF-R)，另一种受体经SDS-PAGE测定的表观分子量为75kD(p75-TNF-R)。这两种形式的TNF受体都已被克隆，具体地说，p55-TNF-R已由Loetscher等人克隆(Cell 61：351-359，1990)，p75-TNF-R已由(例如)Dembic等人克隆(Cytokine 2：53-58，1990)(关于这两种受体还可参阅欧洲专利申请90116707.2)。最近发现，两种受体都不仅与TNF-α结合，而且还以高亲和性与TNF-β结合(Schnfeld等，J.Biol.Chem.2663863-3869，1991)。

本领域公知，根据TNF-α的生物活性，它可能是治疗各种疾病的一种有价值的化合物。例如，单独应用TNF-α或与干扰素合并应用，都可能是一种有效的抗肿瘤剂(Brouckaert等，Int.J.Cancer38：763-769，1986)。然而，其全身性毒性是更广泛的治疗性应用的主要限制(Taguchi T.和Sohmura Y.，Biotherapy 3：177-186，1991)。

现已证明，在小鼠中，只与较小的小鼠TNF受体(鼠p55-TNF-R)结合的人TNF-α(hTNF-α)，其毒性比既与p55-TNF-R又与p75-TNF-R结合的鼠TNF-α(mTNF-α)要小得多。例如，在C57816小鼠中，mTNF-α和hTNF-α的LD₅₀分别约为10μg/小鼠和500μg/小鼠(Brouckaert等，Agents andActions 26：196-198，1989；Everaerdt，B.等，Biochem.Biophys.Res.Comm.163：378-385，1989；Lewis，M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：2830，1991)。因止，p75-TNF-R在全身性毒性中可能起特殊作用。