[发明专利]一种新的头孢菌素C酰基转移酶

说明书

本发明涉及一种新的头孢菌素C酰基转移酶(下文称作“CC酰基转移酶”)。更确切地说，本发明涉及一种用蛋白质工程生产的新的突变型CC酰基转移酶、编码该酶的DNA、含有所说DNA的表达载体、用所说表达载体转化的微生物以及培养所说转化体生产CC酰基转移酶。

头孢菌素C酰基转移酶是能够水解头孢菌素C生成7-氨基头孢菌酸(7-ACA)的一类酶的总称，迄今，已发现三种酶可归入CC酰基转移酶，它们分别称为头孢菌素C酰基转移酶SE83、N176和V22，其氨基酸顺序也已公开(Journal of Fermentationand Bioengineering Vol.72，232-243，1991)。在上述文献中，CC酰基转移酶的氨基酸顺序号始于该顺序N末端部分的蛋氨酸。但是，在本说明书中，CC酰基转移酶的氨基酸顺序号始于与该顺序N末端部分的蛋氨酸相邻的苏氨酸，因为借助于在原核细胞中表达CC酰基转移酶基因获得的成熟CC酰基转移酶的α-亚单位N末端蛋氨酸通常被一种酶(如氨基肽酶)裂解掉，生成以苏氨酸为其N末端氨基酸的成熟CC酰基转移酶。利用重组DNA技术生产天然形式的CC酰基转移酶也在上述文献中公开过，并且业已发现被表达的CC酰基转移酶是经胞内加工形成由α-亚单位和β-亚单位组成的活性形式的。然而，大肠杆菌中的加工效率通常是较低的。基于广泛研究的结果，本发明人成功地生产出具有更多所需特性的突变CC酰基转移酶，其特征为有较高的酶效、较高的加工效率等等。

本发明的新突变CC酰基转移酶其特征如下：

(1)一种突变CC酰基转移酶，其中位于天然CC酰基转移酶氨基酸顺序305位置上的半胱氨酸被其它氨基酸(如丝氨酸等)取代。

(2)一种突变CC酰基转移酶，其中位于天然CC酰基转移酶氨基酸顺序269位置上的蛋氨酸被其它氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸等)取代。

(3)一种突变CC酰基转移酶，其中位于天然CC酰基转移酶氨基酸顺序271位置上的丙氨酸被其它氨基酸(如酪氨酸等)取代。

(4)一种突变CC酰基转移酶，具有选自上述(1)-(3)中的两种或三种点突变。

另外，突变CC酰基转移酶能够用下式代表，作为其加工成为α-亚单位和β-亚单位之前的前体形式：

A^1-268-X¹-Tyr-X²-A^272-304-X³-A^306-773

其中，A^1-268等同于天然CC酰基转移酶中Thr¹至Gly²⁶⁸的氨基酸顺序，A^272-304等同于天然CC酰基转移酶中Gln²⁷²至Tyr³⁰⁴的氨基酸顺序，A^306-773等同于天然CC酰基转移酶中Val³⁰⁶至Ala⁷⁷³的氨基酸顺序，X¹是蛋氨酸或其它氨基酸，X²是丙氨酸或其它氨基酸，X³是半胱氨酸或其它氨基酸，假如X¹是蛋氨酸，并且X²是丙氨酸，那么X³是除半胱氨酸以外的一种氨基酸。

在本说明书中，常规性使用用于命名特定突变CC酰基转移酶的命名法。根据该命名法，用丝氨酸取代天然CC酰基转移酶氨基酸顺序305位置上的半胱氨酸残基所制得的突变CC酰基转移酶应被命名为突变CC酰基转移酶C305S，其中，C是欲被取代的半胱氨酸(一种氨基酸)残基的一个字母缩写，305是天然CC酰基转移酶氨基酸顺序的位置序号，S是用于取代半胱氨酸(前一种氨基酸)残基的丝氨酸(另外一种氨基酸)的一个字母缩写。另一方面，例如，突变CC酰基转移酶M269Y或M269T是分别用酪氨酸或苏氨酸取代天然CC酰基转移酶氨基酸顺序269位置上的蛋氨酸残基制得的。突变CC酰基转移酶M269Y/C305S则是用酪氨酸取代天然CC酰基转移酶氨基酸顺序269位置上的蛋氨酸残基和用丝氨酸取代天然CC酰基转移酶氨基酸顺序305位置上的半胱氨酸制取的。

本发明的突变CC酰基转移酶还可以借助重组DNA技术、多肽合成法等方法制备。