[发明专利]一种抗生素新农药——宁南霉素

说明书

本发明属于微生物发酵工程技术。

宁南霉素属碱性水溶性胞嘧啶核苷类抗生素，主要用于防治水稻白叶拈病，也可用于防治水稻小球菌核病、小麦白粉病、蔬菜白粉病、烟草花叶病毒病等。目前国内外用于防治水稻白叶枯病的主要药物是化学农药，以叶枯宁、叶枯净为代表。

五十年代以来，由于化学农药的使用带来环境污染，造成公害，因此，无公害农药——农用抗生素的研制在国际上受到极大重视，日本是农用抗生素研究最有成就的国家之一，为防治稻瘟病、稻纹枯病，先后投产了“灭瘟素s”、“多氧霉素”、“春日霉素”、“有效霉素”、“灰黄霉素”、“放线菌酮”等，但对水稻白叶枮病等未见大田试验报导，印度、中国和西方一些国家，也开展了同类研究，报导了IIerbicidin，Azomultin，Crtromycin，Xanthostiu，Nogimyein，Prumycin等十多种对水稻白叶枯病原菌有较强生理活性的抗生素，但由于药害和其它一些原因，也未见防治水稻白叶枯病的大田应用报导。    

为了控制病害，提高粮食产量，净化环境，保证人畜健康，寻找高效、低毒、低残留，无“三致”和蓄积作用的无公害广谱抗生素农药，是本发明的主要目的。

本发明的技术解决方案是：筛选对水稻白叶枯病原菌有高生理活性的抗生素产生菌种→对产生菌进行分类鉴定→进行发酵条件试验→对产生的抗生素进行分离和结构鉴定→生产工艺→毒理试验→大田试验。

本发明的主要内容：

1.产生菌的鉴定

宁南霉素产生菌16A-6菌株，根据形态特征，生理生化特性，碳源利用，细胞壁组份分析和拮抗性等试验结果：形态特征：在高氏一号培养基上，孢子丝为松敞螺旋，电镜下，孢子呈椭圆形0.9×1.3μm，圆形直径1.2μm，孢子表面带细刺；培养特征：在高氏琼脂培养基上生长丰茂，短绒状，气生菌丝体由深蛛网灰转淡红灰，有白色次生菌丝，基内菌丝体淡灰黄，无可溶性色素；生理生化特性：在酪氨酸琼脂上不产生黑色素，淀粉水解，明胶液化，牛奶胨化，硝酸盐还原，不产生硫化氢，纤维素上不生长：碳源利用，可利用D——葡萄糖，D——果糖、蔗糖、甘露醇、肌醇，不利用鼠李糖，棉子糖，对D——木糖、L——阿拉伯糖利用可疑；细胞壁组分为I型；拮抗性：菌株培养液对革兰氏阴性细菌，少数革兰氏阳性细菌，酵母菌，水稻纹枯病原菌，稻瘟病原菌，油橄榄疮痂病原菌有抑制作用，对水稻白叶枯病原菌和小球菌核病原菌抑制作用强。

根据以上结果，将此菌株与诺尔斯链霉菌比较，认为链霉菌16A-6菌株是诺尔斯链霉菌的一个新变种，定名为诺尔斯链霉菌西昌变种(Streptomyces noursoi var.xichangansisn.var)。保藏号为：CGMCC NO.0194保藏日期：1993年4月23日保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京)

2.抗生素宁南霉素(16A-6I)的分离和鉴定

发酵液过滤后，滤液通过732^#NII₄⁺型阳离子交换树脂后，用无盐水洗去上层蛋白质沉淀，再用0.3N氨水洗脱，收集磷钨酸反应阳性部分，减压浓缩至小体积，浓缩液通过D-110大网树脂，吸附层析，用无盐水展层，收集磷钨酸反应部分，冻干得白色粗品，粗品经中性氧化铝柱层析，先用10倍体积75％甲醇水溶液洗，再用25％甲醇水溶液洗，收集磷钨酸反应阳性部分，减压浓缩，冻干得白色无定形粉末，最后再经高效液相色谱进一步纯化，得宁南霉素(16A-6I)色谱纯样品。

将宁南霉素(16A-6I)白色无定形粉末，进行理化性质检测，熔点195℃分解，旋光度[a]_D²⁵+38°，分子量444[质谱法]，分子式：C₁₆II₂₅N₇O₃，易溶于水，难溶于醇、酮、醋酸乙脂、氯仿等一般有机溶剂，在pH2-8磷酸缓冲液中进行纸上电泳，移向负极，显碱性。显色反应：茚三酮、双缩脲、高锰酸钾、磷钨酸呈阳性、坂口三氯化铁、蒽酮、α-萘酚呈阴性。

对16A-6I进行紫外光谱、红外光谱、核磁共振谱及水解产物等化学分析，确定宁南霉素16A-6I为谷氏菌素同分异构体，差别在于组成结构成分中，前者为L丝氨酸，后者为D丝氨酸，抗菌生理活性有明显差异，综上分析，农抗16A-6I为首次发现的胞嘧啶核苷肽型新抗生素，定名为宁南霉素，其结构式为：

3.宁南霉素的生产工艺流程：