[发明专利]单纯感觉(或运动)神经纤维酶标抗体的制备方法

说明书

本发明涉及酶标抗体的制备方法，特别是单纯感觉（或运动）神经纤维酶标抗体的制备方法。

周围神经断伤后，感觉束与运动束难以快速、准确鉴别，从而限制了缝合的准确性，也一定程度上困扰着神经外科的进步，术后优良率无法明显提高。目前，采用的物理和化学方法进行术中鉴别，但这些方法不够理想、实用。因此，有必要提供一种鉴别单纯感觉（或运动）神经纤维的定性方法。

本发明目的是提供一种可以定性鉴别单纯感觉（或运动）神经纤维酶标抗体的制备方法;利用酶标抗体鉴别单纯感觉（或运动）神经纤维的方法，该方法操作简单，易于观察，显色迅速，实用性强，特异性强。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：它包括以下步骤：（1）制备人感觉（或运动）神经抗原乳剂：在15倍手术显微镜下抽取人体的单纯感觉（或运动）神经纤维，以Hank′S液体洗掉血细胞，将神经纤维研磨成浆状物，其浓度为25mg/ml-50mg/ml，神经纤维浆状物与弗氏佐剂按1∶3（体积比）加压混合成油包水乳剂，液氮储存备用;（2）将抗原乳剂免疫动物制备抗体：分三次注射，其时间间隔及用量分别为：第一次，4-8ml，滴后第二次注射用量3-5ml，一周后第三次注射，用量为3-5ml，第三次注射后二周，抽血检测IgG含量;（3）用Sephadex    G200层析，提纯抗体;（4）按改良戊二醛二步法将上述动物血清与辣根过氧化物酶（HRP）交联。

以下结合实施例对本发明作进一步说明：

实施例1：

在15倍手术显微镜下分段抽出神经纤维，用Hank′S液体洗掉血细胞，将神经纤维研磨成浆状物，其浓度为25mg/ml，浆状物与弗氏佐剂以1∶3（体积比）加压混合，制成油包水的人感觉神经及运动神经抗原乳剂，液氮储存备用;将抗原乳剂注入羊腹腔内，第一次注射6ml，3周后第二次注射4ml，1周后第三次注射4ml，抽血检测IgG，其含量为2.94g/l;将羊血清与辣根过氧化物酶交联，其步骤包括：（a），将60mg辣根过氧化物酶（HRP）溶于1ml    PH6.8/0.2M磷酸盐缓冲液（PBS）中，逐滴加入2.5%GA（戊二醛）溶液1ml，置室温18小时后，装入透析袋在生理盐水中透析，除去GA;（b），透析袋内液体置称量瓶中，加入PH9.5/1M碳酸盐缓冲液1ml，4℃搅拌24小时，（c），加入0.2M赖氨酸1ml，封闭被GA激活的酶的残基，室温2小时后，装透析袋内，在PH7.2/0.15MPBS中4℃透析过夜（d），透析袋内液体在电磁搅拌下滴加饱和硫酸铵，于4℃冰箱中静置1小时后，以4000rpm离心15分钟，弃上清，沉淀用半饱和硫酸铵洗涤二次，溶于PH7.2/0.15MPBS中以同样的PBS4℃透析2-3天，至无MH4⁺为止，（e），取出透析袋内液体以4000rpm离心30分钟，取上清液，测定效价、分装、冰冻保存备用。

上述制备方法得到的酶标抗体，用于鉴别感觉神经或运动神经的方法如下：

将待染组织片段置入试管中，加入上述酶标抗体血清1ml，在37-38°温箱中温育，时间为25分钟，温育时间也可以长一些，例如55分钟，115分钟，取出待染组织，用PH7.2/0.15M的磷酸缓冲液冲洗掉未反应的酶，加入底物1%邻联甲苯胺（OT）（其中含1%双氧水，临用前现配），作用后5分钟后，，加入2MH₂SO₄终止反应。手术显微镜下观察结果，这种酶标抗体特异性强，感觉神经迂羊抗人感觉神经酶标抗体与底物显兰色，与运动神经不显色，运动神经迂羊抗人运动神经酶标抗体与底物显色，与感觉神经不显色。

本发明优点：本发明提供的酶标抗体分装后，可较长时间保存，使用方便，采用本酶标抗体鉴别感觉神经或运动神经的方法，优于现有的其他方法，现有的胆碱酶组织化学染色法，操作复杂，时间较长，准确性差，临床应用受到限制，本鉴别方法操作简单，易于观察（肉眼或显微镜下观察），敏感性高，特异性强，手术医师术中可亲自观察。