[发明专利]修饰的人粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子基因及其在酵母菌中的表达

说明书

本发明涉及一种修饰的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“hGM-CSF”)基因和其表达；具体地说涉及一种用于在酵母中大量生产hGM-CSF的修饰的hGM-CSF，一种含该基因的表达载体，一种用所述的表达载体转化的酵母细胞以及用这种酵母细胞生产所述的hGM-CSF的方法。

集落刺激因子(CSF)为一族淋巴细胞因子(lymphokines)，它诱导祖细胞(progenitor)分化成成熟血细胞的特殊型细胞。来源于祖细胞的特殊类型的成熟血细胞取决于现存的CSF的类型。已知的CSF类型包括G-CSF(Nicola et al.,J.Biol.Chem.258 9017-9021(1983)),M-CSF(Standley et al.,J.Biol.Chem.252,4045-4052(1977)),GM-CSF(Burgess et al.,J,Biol.Chem.2521991-2033(1977))和multi-CSF(Burgess et.al.,Biochem.J.185,341-343(1980))。

已知刺激粒细胞-巨噬细胞集落生成的GM-CSF可在各种细胞中产生，这类细胞包括诸如上皮细胞，巨噬细胞和淋巴细胞，并且用于造血细胞的再生，治疗外源性感染和骨髓样白血病。

1985年，用鼠GM-CSF cDNA(Michael et al.,P.N.A.S.826250-6254(1984)从HUT-102动物细胞的T-淋巴细胞中分离得到的mRNA制备的全部cDNA克隆中选择得到编码hGM-CSF的cDNA克隆。用含有α因子启动子和α因子前导(leader)序列的酵母表达体系，从一种酵母细胞中分泌表达出hGM-CSF。

同时，Nicholas等和Gordon等也分别报道了在COS-1动物细胞中表达hGM-CSF基因的结果(Nicholas etal.,EMBO4,645-653(1985)；and Gordon et al,Science 228,810-815(1985))。

另外，GM-CSF包括两N-连接的糖基化识别位点，即天冬氨酸-X-丝氨酸和天冬氨酸-X-苏氨酸(Asn-X-Ser和Asn-X-Thr，其中X是任何氨基酸)，因此，它可以糖基化形式以分子量介于35至100Kd在动物细胞或者酵母细胞内产生，这是由于异源性的N-糖基化作用的原因。(Joachim et al.,Bio/Technology 5,831-834(1987))。

从而，很难纯化动物或酵母细胞中产生的糖基化的GM-CSF；因此产量低。

另外，据报道鼠的GM-CSF基因同人类GM-CSF约50％的核苷酸序列相同，但也包括编码两个N-连接的糖基化识别位点的密码子，这种基因已在大肠杆菌中表达出来，并具有同天然鼠GM-CSF相同的生物活性，尽管制备出的GM-CSF不被糖基化。(DeLamarter et al.,EMBO4,2575-2581(1985))。

然而，同酵母做为宿主细胞相比，大肠杆菌有不足之处，即在大肠杆菌中制备的hGM-CSF可能会被大肠杆菌天然蛋白如内毒素污染，尽管是纯化后，也有可能。而酵母不产生任何对人体有害的物质，事实证明：酵母在食品加工业中已被使用了几个世纪。因此，在酵母中大量产生无-N-糖基化的hGM-CSF是理想。

按照本发明，发现在酵母中可以表达一种修饰后的hGM-CSF基因，以制备具有几乎相同分子量的高产率的hGM-CSF。修饰后的hGM-CSF基因的核苷酸序列被修饰成具有酵母优选(Yeast-preferred)的密码子，这种密码子倾向于强烈表达的酵母基因，诸如，甘油醛-3-磷酸(酯)脱氢酶基因和乙醇脱氢酶基因(Bennetzen,J.M.&Hall,B.D.,J.Biol.Chem.257,3026(1982))而不改变其中的氨基酸序列，并通过氨基酸取代灭活N-糖基化位点，同时保持所述的hGM-CSF的生物活性。

因此，本发明的目的在于提供一种有效的修饰后的hGM-CSF基因，它可用于在酵母中大量制备无-N-糖基化的hGM-CSF。

本发明的另一目的在于提供一种含有所述hGM-CSF基因的表达载体，和用表达载体转化的酵母细胞。

本发明的进一步目的在于提供一种用酵母转化株生产无-N-糖基化hGM-CSF的方法。