[发明专利]肝肽素的纯化和部分氨基酸序列

说明书

本发明涉及一种刺激肝细胞DNA合成的生物药品肝肽素的纯化和部分氨基酸序列。

近年来，国内外广大学者对肝病的治疗，愈来愈注重选用对肝细胞的再生药物，其来源和制备方法各不相同。最早LaBrecque从大鼠再生肝中提取“肝刺激物质”（Hepatic stimulator substamce，HSS），Nakamura从血小板中提取“肝细胞生长因子”（Hepatocyte Growth Factor，HGF）。国内陈光明等从乳猪肝中提取HGF，苏先狮等用改良的Labrecque方法从乳猪肝中提取刺激生长因子即肝肽素粗品，并于1991年申请了中国专利。

本发明的目的是提供肝肽素粗品的进一步纯化和部分氨基酸序列。

本发明是将肝肽素粗品的冻干品，采用反向C₄-高效液相色谱进行纯化，色谱柱为Delta PackC₄300A（3.9mm×30cm）层柱温度42℃，流速0.7m/min。第一次纯化时检测波长280nm和230nm，洗脱液A：0.1%TFA水溶液;B：100%乙腈（含0.1%TFA）洗脱梯度0～30分钟，乙腈线梯度0～75%;30～35分钟，保持75%乙腈，35～40分钟，乙腈线性梯度为75～0%。第二次样品纯化时，检测波长280nm流动相A：0.1%TFA水溶液;B：100%乙腈（含0.1%TFA）洗脱梯度0～25分钟，乙腈线性梯度0～75%，25～30分钟，75%乙腈保持5分钟，30～35分钟，乙腈75%～0%。

纯化后的肝肽素，其分子量为2.1万道尔顿，对42℃30分耐热，对酸碱稳定，经Milligen 6600型固相蛋白质顺序分析仪测得N-末端氨基酸残基的排列顺序为N-Asp-Glu-Lys-Ser-Phe-Lye-Trp-Lys-Ala-Thr。

本发明能刺激肝细胞DNA的合成，对慢性活动性乙型肝炎，能明显抑制谷丙转氨酶的活性，降低血清总胆红素，升高A/G比值，有效地促进肝功能的恢复。并能抑制血清肿瘤坏死因子（STNF）水平及外周血单个核细胞诱导的肿瘤坏死因子（PBMC-TNF），具有一定的免疫调节作用。治疗慢性肝炎的有效率94.3%，肝硬化的有效率82.8%，重症肝炎的存活率81.9%。

附图1：第一次纯化反向C₄-HPLC图谱

附图2：第二次纯化反向C₄-HPLC图谱

附图3：氨基酸序列图谱

实施例1：120ug，肝肽素粗品的冻干品，溶于100微升0.1%TFA水溶液中，色谱柱为：Delta Pack C₄300A（3.9mm×30mm），层柱温度：42℃，流速：0.7ml/min，检测波长280nm和230nm，洗脱液A：0.1%TFA水溶液，B：100%乙腈（含0.1%TFA），洗脱梯度：0～30分钟乙腈线性梯度0～75%，30～35分钟，保持75%乙腈，35～40分钟乙腈线性梯度为75%～0%。

（图谱见附图1）

实施例2：

将第一次反向C₄-HPLC的肝肽素组份（附图1中的B组份）4ml冻干，溶于100微升0.1%TFA水溶液，色谱柱：Delta Pack C₄300A（3.9mm×30cm），层析温度：42℃，流速：0.7ml/min，检测波长280nm，流动相A：0.1%TFA水溶液，B：100%乙腈（含0.1%TFA）洗脱梯度0～25分钟，乙腈线性梯度0～75%，25～30分钟75%乙腈保持5分钟，30～35分钟乙腈75%～0%。

（图谱见附图2）