[发明专利]肝靶向性的半乳糖基干扰素偶联物

说明书

本发明涉及的是一种由半乳糖与蛋白质物质联接所成，在动物和人体内具有明显肝靶向性特征的偶联物。

将具有生理或药理活性的蛋白质与可以同机体某些组织或器官具有特异亲合性结合的物质以偶联或其它适当方式连接成一个复合型物质，是提高活性成分的生理、药理作用及针对性，减少药品用量，降低或避免毒副作用的一个重要途径。例如，欧洲专利0119650A2介绍了一种对治疗糖尿病有价值的半乳糖胰岛素偶联物。日本专利平1-102099通过以遗传因子制备方法介绍了一种将末端具有半乳糖-半乳糖基的糖链与蛋白质相连接，使分子中含糖量大于20%，具有趋肝特性的生理活性糖蛋白质。哺乳类动物肝细胞膜上的肝结合蛋白（HBP）是一种含有半乳糖基的去唾液酸糖蛋白的受体。由于这一发现对肝肿瘤、肝硬变、肝炎等肝脏疾病的诊断和治疗将具有特别的意义，因此自1966年这一发现被公布后，已有许多学者对此作了深入研究，利用半乳糖基的这一趋肝亲合特征寻找有价值的药物结构。上述日本专利虽提出了制备含有半乳糖基趋肝性生理活性糖蛋白质物质的概念，但遗憾的是对其化合物结构，以及肝靶向性实验研究、效价等重要内容均未作出明确的报道。

本发明的目的在于提供一种由化学方法合成的具有显著的肝靶向特性因而可望成为有价值的肝脏疾病治疗药物的半乳糖基干扰素偶联物。

本发明提供的偶联物（Ⅰ）为[2-亚氨基-甲氧乙基-硫代-β-）-D-半乳吡喃糖甙]基-2-干扰素，其结构为

其中的半乳糖在化合物分子中的分子比最好为2-3∶1。

本发明偶联物（Ⅰ）的化学合成方法，可以参照上述欧洲专利的方法，以β-D-半乳糖依次与硫脲及氯乙腈反应得到氰甲基-1-S-D-半乳糖甙，再在甲醇钠或HCl的甲醇环境下转变成2-亚氨基-2-甲氧乙基-1-S-D-半乳糖甙。最后在pH8～8.5的微碱性条件下与干扰素中的碱性氨基酸中的游离氨基反应，连接成偶联物（Ⅰ）。例如，可采用下述具体方法合成：

1°，将各羟基已被乙酰基保护的氰甲基-1-S-D-半糖甙（可参照上述欧洲专利方法制备）与无水甲醇混合后微加热使完全溶解，于20℃加入2.5M的甲醇钠溶液，恒温反应48小时。减压蒸除甲醇后得到白色泡状固体。用pH8.0的磷酸缓冲溶液稀释溶解，HCl调节保持pH8.0。

2°，将由基因工程得到的干扰素α和上步所得到的溶于磷酸缓冲溶液中的中间产物混匀，用pH8.6的缓冲液调节反应液为pH8.0，于4℃下搅拌反应24小时，得偶联物（Ⅰ）。控制1°反应后的中间产物与2°中加入的干扰素的用量比，可在一定范围内调节偶联物（Ⅰ）中半乳糖在分子中所占的比例。

对上述所得到的偶联物（Ⅰ）可以采用含0.73%的NaCl的pH7.3的磷酸缓冲液以常规方法进行透析处理纯化，除去未反应的半乳糖试剂。透析纯化结果可用苯酚-硫酸法测定其含糖情况。

采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法可以分别测定出偶联物（Ⅰ）和所用的原料干扰素α的分子量。例如，经平板垂直电泳后，用含0.05%考马斯亮蓝R-250染色液染色后的上述产物电泳图如图1所示。图中的a为偶联物（Ⅰ），b为原料干扰素α，c为标准蛋白质。

由于经过上述反应，在干扰素α中带上了半乳糖基，其分子量将会增加。用偶联物（Ⅰ）的分子量与干扰素原分子量之差及其与半乳糖基的质量数之比即可确知在偶联物（Ⅰ）中带有的半乳糖基的数目，从而计算出偶联物（Ⅰ）中的糖密度。例如在上述反应过程中，1°中投入200毫克所说的氰甲基-1-S-D-半乳糖甙，2°中取0.6倍的中间产物与10毫克干扰素α1反应后制备得到的偶联物（Ⅰ），用此方法测得偶联物（Ⅰ）的分子量为15296D，原料干扰素α1的分子量为14752D。半乳糖基（C8H1105NS）的质量数为233D，由此可计算出此偶联物（Ⅰ）中的半乳糖基数为2.335，即平均每一分子干扰素α1上连接有2～3个半乳糖，也即糖密度为2～3。

以由上述方法制备、纯化并确认了结构及糖密度为2～3的偶联物（Ⅰ）作为试验用样品进行了其在动物体内的靶向性研究。