[发明专利]肝炎病毒多项免疫标志一孔测定法

说明书

本发明属于肝炎病毒免疫标志的酶免疫方法。

肝炎病毒的免疫标志主要有抗HAV（抗Hepatitis A virus，甲肝病毒抗体）、HBsAg（Hepatitis B surface Antigen，乙肝病毒表面抗原）、HBeAg（Hepatitis B e Antigen，乙肝病毒e抗原）、抗HBc（抗Hepatitis B core，乙肝病毒表面抗体）、抗HBe（抗Hepatitis B e，乙肝病毒e抗体）、抗HCV（抗Hepatitis C virus，丙肝病毒抗体）。这些病毒免疫标志经常采用酶联免疫吸附试验检查。但这种酶免疫方法要使用多孔的酶标反应板，每孔只能检查一个免疫标志，使用上很不方便。

本发明的目的在于提供一种在酶标反应板一孔中通过一次操作，即能同时显示两项或两项以上肝炎病毒免疫标志的快速简便的测定方法。

本发明的另一目的在于提供一种相应于上述肝炎病毒免疫标志测定方法的酶标反应板。

通常的酶免疫吸附试验法测定肝炎的免疫标志主要应用夹心法和竞争法两种，检查乙肝病毒表面抗原（HBsAg），乙肝病毒表面抗体（抗HBs）和乙肝病毒e抗原（HBeAg）应用的是夹心法，存在免疫标志时显色;反之，不显色。乙肝病毒e抗体（抗HBe）和乙肝病毒核心抗体（抗HBc）采用的是竞争法，待检抗体阳性时不显色，否则显色。这种酶免疫法先要将抗原或抗体包被（即吸附）在酶标反应板孔中，待检血清中存在相对应的抗体或抗原时，就通过抗原、抗体间的反应结合到反应板上。然后同时加入的辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase简写为HRP）标记的抗原或抗体，通过待检血清中的抗体或抗原结合到酶标反应板上（夹心法），或受血清中抗体的竞争不能结合到板上（竞争法），再加酶的底物溶液后，酶催化底物而显色，从而确定待检血清中是否存在抗原或抗体。由于抗原与相应抗体会起反应，酶标HBsAg和酶标抗HBs不能处于同一溶液中。因此，反应板上的同一个孔中只能测定一个免疫标志，各种酶标物需要分隔存放。但经发明人研究证实，若将酶标板的每个孔分隔为2-5个小孔，各小孔中分别包被不同的抗原或抗体，则它们之间不会相互干扰影响，待检血清中的各种肝炎病毒免疫标志会分别与小孔中包被的抗原或抗体相结合。并且，同一溶液中的酶标记物：抗HBs-HRP，抗HBe-HRP和抗HBc-HRP不会相互反应。这种酶标记物混合液加入大孔中，又可各自与小孔中的抗原、抗体相结合。因此，可以通过加一次血样和一次酶结合物，在一个大孔中能同时显示肝炎病毒的多项免疫标志。

本发明将酶标反应板设计成下述形状（如附图1-7所示），一般长度为110-140mm，宽度为45-70mm，厚度为10-15mm，可安排4×10个大孔。实际上其大小及大孔数不受限制。关键是对大孔的设计。大孔（1）直径一般为6-12mm，孔深10-14mm，将每个大孔分隔为2-5个小孔，每个小孔（2）底面积为5-15mm²，分隔层（3）高度为5-8mm，厚度为0.7-1.1mm。图1为酶标反应板的结构示意图。图2、图3为将大孔分隔为2个小孔的示意图。图4、图5为将大孔分隔为3个小孔的一种结构示意图。图6、图7为将大孔分隔为5个小孔的一种结构示意图。本发明提出的测定肝炎病毒免疫标志的步骤如下：在每个大孔的2-5个分隔小孔中分别包被不同的肝炎病毒免疫标志，即分别包被不同的抗原或抗体，包被物浓度为0.5-20ug/ml，反应条件一般为39℃±3℃，2-5小时，或者在6℃±2℃，15-48小时。试验时，对每个大孔中分别加待检血清，一般为0.05-0.2ml即可，同时各大孔中加入相应于小孔中包被的抗原或抗体的酶标记物的混合液0.1-0.3ml，在39℃±3℃中反应30-60分钟。然后去除孔中液体。并用洗涤液洗去未结合物，加上四甲基联苯胺（TMB）底物系统。一般每小孔中45-55ul，10分钟左右后即在一个大孔中显示待检血清各项免疫标志的阴性或阳性结果。

在本发明提出的方法中，只要在酶标反应板的大孔的分隔小孔中任意选定包被物，并加入相对应的酶标记物的混合液，可以测定肝炎病毒免疫标志任意组合成的两项以上的免疫标志。下面是各种常用组合的举例：

如果在酶标反应板的一个大孔中的分隔小孔中分别包被抗HBs、抗HBe、HBcAg，则在酶标物反应步骤中加入相应的抗HBs-HRP、抗HBe-HRP、抗HBc-HRP酶标记物混合液，可以测定乙型肝炎表面抗原（HBsAg）、乙型肝炎e抗原（HBeAg）和乙型肝炎核心抗体（抗HBc）三个免疫标志。