[发明专利]口蹄疫疫苗的生产工艺

说明书

本发明属于动物疫苗。特别是一种口蹄疫疫苗的生产方法。

口蹄疫(FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)所致的偶蹄动物的一种急性发热性高度传染性疾病。在其病程中，在粘膜和皮肤上，特别是口腔和蹄叉中发生特征性水泡症状。该病为国际兽医局规定的A类动物流行病的第一个病害。

FMDV属于小核糖核酸病毒科口蹄疫病毒属。有7个血清型，即O、A、C、Asia-I和SAT₁、SAT₂、SAT₃，共计60余个亚型。

FMD流行面广，发病率高，曾在世界范围内造成巨大的经济损失，现在除少数地区和国家消灭了这种疫病外，在亚洲、非洲、南美洲以及欧洲部分地区仍然相当猖獗。

在防止FMD的综合措施中，采用疫苗接种的特异性预防方法，对控制本病流行和净化疫源地在我国以及世界许多国家都证明是行之有效的。

目前，国外在细胞悬浮培养、病毒繁殖，病毒灭活方面采用了微电脑控制的先进设备，疫苗配制及乳化均采用大缸或密封管道化。这样可减少大规模生产中的污染，使制造工序标准化，从而保证了疫苗的质量。

目前，国内所生产的FMD灭活疫苗，如我们中国农科院兰州兽医研究所生产FMD灭活疫苗使用的是传统的转瓶培养单层细胞繁殖病毒。原生产规程规定，1.5万毫升容量的转瓶需病毒及维持液3000毫升，相关于每平方厘米细胞单层1.0-1.2毫升病毒液。收获病毒液每毫升含病毒不中0.8微克，没有任何浓缩手段，直接用于疫苗配制，免疫动物(猪)只能耐受20-40ID50的强毒攻击，不能耐受同居感染。

FMD疫苗的效力，关键取决于抗原含量能否达到合理水平。国外大量实验认为FMD疫苗每毫升(1头份)应含有效抗原(146S)2-10微克，每毫升配苗病毒液大于10₇TCID50，免疫动物(猪)可耐受100个ID50以上的强毒攻击。国内疫苗对少量病毒感染或毒力不强毒株感染，可以起到一定作用，但对大爆发则显示出效力的严重不足。

本发明的目的是研究高效力的FMD疫苗。在不增加投资情况下，利用现有设备条件，改造生产工艺中的关键环节，大幅度地提高疫苗中的有效抗原含量，使疫苗的效力达到国际水平。

实现本发明目的的技术方案包括提高病毒浓度、提高转瓶机速度、改变疫苗配制程序等工序。

繁殖病毒的程序是在单层细胞长满后，加入病毒培养液，种毒10％，细胞培养用水解乳蛋白90％，用7.5％NaHCO₃调节PH7.6-7.8，每个转瓶中病毒培养液的加入量按每平方厘米细胞单层0.2-0.3毫升(随种毒不同而异)，病毒滴度每毫升超过10⁸TCID50，病毒含量每毫升3-4微克；

制苗程序是将解冻的大于10⁸TCID50/ml病毒液加入二乙烯亚胺(BEI)使之终浓度为2.5/10000，再用80目铜纱网过滤除去细胞碎片，并将加灭活剂的病毒液转入一个新容器，35-38℃水浴升温，使病毒液升至30℃，置于30℃温室，作用26小时，其中每3小时摇振一次，26小时后加入硫代硫酸钠使终浓度液为2.0％，于30分钟后即可配制疫苗。

疫苗的配制采用水/油/水双相油乳剂，三者比例为3/5/3，即取5份含10％司班80的白油加入乳化器不停搅拌并缓慢加入水相抗原3份，搅拌为绸状态均匀后，再加入3份含4％吐温80的抗原水相搅拌均匀后即可以。

现就本发明的生产方法及工序作详细说明：

(1)按过去常规方法培养转瓶细胞单层(转瓶转速7-8转/小时)。

(2)繁殖病毒的程序是在单层细胞长满后，加入病毒培养液，种毒10％，细胞培养用水解乳蛋白90％，用7.5％NaHCO₃调节PH7.6-7.8。每个转瓶中病毒培养液的加入量按每平方厘米细胞单层0.2-0.3毫升，病毒滴度每毫升超过10⁸TCID50，病毒含量每毫升3-4微克。