[发明专利]大潜在转化生长因子-β复合物及其有用结构物的生产方法

说明书

本发明涉及转化生长因子-β（TGF-β）。具体说，本发明涉及在真核细胞（如中国仓鼠卵巢细胞（CHO））表达大潜在TGF-β复合体。同时，本发明也描述了在真核细胞中表达这种大潜在TGT-β（LL-TGF-β）复合体及其后来对该复合体的纯化。本发明进一步涉及以上所述的rLL-TGF-β中分离大潜在相关肽（L-LAP）的一种方法。

转化生长因子-β是一大类对许多类型细胞具有潜在细胞调节活性的蛋白质。（参见Roberts和Sporn，肽生长因子和它们的受体I，419-472，1990）。人TGF-β的三种同型异构体（TGF-β₁，-β₂，β₃）已经被确定且其特征也已搞清楚。TGF-β₁是首次被鉴定作为一种生长因子，它可在半固体琼脂上刺激一些啮齿类动物成纤维细胞生长。然而现在越来越清楚地认识TGF-β₁，对许多不同类型的细胞来说也是一种潜在生长抑制物，一种细胞分化的调节剂和一种细胞外基质的生产和沉积作用的诱导物。

TGF-β₁作为一种高分子量的潜在复合体可由广泛的多种多样正常和肿瘤细胞产生。从人的血小板（Miyazono et al.，J.Biol.Chem.263，6407-6415，1988;Wakefield et al.，J.Biol.Chem.263，7646-7654，1988）和大鼠血小板（Okada et al.，J.Biochem.106，304-310，1989）纯化后的潜在TGF-β₁的结构已经被确定。已经使用人红白血病细胞系搞清了它的生物合成（Miyazono et al.，EMBO J.10，1091-1101，1991）。

这种潜在型的TGF-β₁是由三种不同的组分组成：1）成熟的TGF-β₁;2）TGF-β₁前体的N-末端残余部分;3）潜在的TGF-β₁结合蛋白（以下被称为LTBP）。TGF-β₁前体的N-末端残余部分对于TGF-β潜在性是非常重要的，所以这就被表示为TGF-β₁潜在性相关肽（β₁-LAP）（Gentry et al.，Biochemistry，29，6851-6857，1990）。象本发明所称的那种大潜在性相关肽（rL-β₁-LAP是由两种组分组成，即TGF-β₁潜在性相关肽（β₁-LAP）和LTBP。

成熟TGF-β₁是一种二硫键连接的二聚体，它是以β₁-LAP中经蛋白酶切割而成，形成了一个连接LTBP单一分子上二硫键的二聚体。含LTBP的潜在TGF-β₁复合物称为“大潜在复合物（1arge latent complex，LL-TGF-β₁）”，而不含LTBP的复合物称为“小潜在复合物（small latent complex）”（Wakefield et al.，Growth Factors，1，203-218，1989;Miyazono et al.，EMBO J.，10，1091-1101，1991）

LTBP首次以自由形态和作为LL-TGF-β₁复合物的一种组分从人血小板中纯化而得到。编码LTBP的cDNA克隆最近也从人前皮成纤维细胞中分离出来（参见U.S.serial NO.07/487，343，美国专利5177197号，这些文章的内容结合参考文献会给一个全面的认识）。cDNA序列的敞开阅读框架指出LTBP是一个由1394个氨基酸组成的蛋白质，它含有2种不同类型重复序列，16个类表皮生长因子（EGF）的重复片段和在一个基元序列中含有8个半胱氨酸重复顺序的3个拷贝。在一些类EGF重复顺序，β-羟基化天冬酰胺残基已被鉴定出来（Kanzaki et al.，Cell61，1051-1061，1990）表明LTBP是一种Ca²⁺结合蛋白（Dahlback et al.J.Biol.Chem.266，18481-18489，1990）。LTBP不直接与TGF-β₁潜在性相关，但它在由生产细胞装配和分泌潜在TGF-β₁分子中起一定作用。