[发明专利]用于内毒素特异检测的试剂、药盒和方法

说明书

本发明涉及一种特异地检测内毒素的试剂，它含有固定在不溶载体上的内毒素敏感的凝血因子，一种包括该试剂的内毒素检测药盒，一种用所说试剂特异检测内毒素的方法。

采用鲎血细胞(变形虫状细胞)提取物(即鲎变形虫状细胞溶胞产物，以下简称为溶胞产物)检测内毒素(以下叫作Et)的方法，称为鲎试验，已为公众所知。参予检测的溶胞产物的反应，叫作鲎反应。鲎试验具有高检出敏感性，而且广泛地用于药物、水测定法、临床试验等热原检查工作中。鲎试验基于痕量内毒素存在下溶胞产物的凝结作用。最近的生物学研究阐明了这样一个事实，即鲎反应由几种凝结因子的分步活化组成(参见Takanori Nakamura等，日本细菌学杂志，38，781-803(1983)。

所说的鲎反应现参照图1就由三刺鲎(Tachypleus tridentatus)得到的溶胞产物详细说明如下。在溶胞产物中加入Et时，在该溶胞产物中存在的Et-敏感因子(内毒素敏感的因子，分子量为123000)被活化。此活化的因子C在特定位点使因子B(分子量；64000)有限水解生成活化的因子B。此活化的因子B使预凝固酶(分子量；54000)活化，将其转化成凝固酶。此凝固酶使凝固原(Coagulogen，凝血蛋白，分子量19723)在由二硫键交联的环中，即在…Arg¹⁸和Thr¹⁹…以及…Arg⁴⁶和Gly⁴⁷…之间的特定位点处有限水解，释放出由

              H-Thr¹⁹……Arg⁴⁶-OH所表示的肽C(28氨基酸残基)，同时将其余部分转化成凝固素凝胶。因此鲎反应由一系列反应(由Et引起的级联反应，以下叫作因子C系统反应)组成。

上面提到的溶胞产物的级联反应，不仅由Et，而且还由(1→3)-B-D-葡聚糖(以下简叫β-葡聚糖)所诱发。就是说，图1中的因子G被β-葡聚糖活化，而活化的因子G将预凝固酶转化成凝固酶，而且凝固酶在凝固作用时生成凝固素凝胶，其作用方式与上述的由β-葡聚糖引起的级联反应(以下叫作因子G系统反应)中的相同。

通过所说的级联反应产生的凝固酶，也能够使单独地加入该反应体系中的合成底物(例如叔丁基羰基-亮氨酸酰-甘氨酸-精氨酸-N硝基-N-苯胺)(Boc-Leu-Ely-Arg-PNA)的酰胺键水解，释放出对硝基苯胺。因此，Et或β-葡聚糖可以通过测量所释放出的对硝基苯胺之光吸收的方法定量测定。

有人提议使用已除去因子G的溶胞产物，只根据因子C体系特异测定Et，参见Obayashi T.等在临床化学学报，149，55-65(1985)中所披露的内容。

但是，此方法涉及极其复杂的制备元因子G体系的操作，其中包括采用其上固定有葡聚糖硫酸盐亲和载体的亲和色谱法分步分离溶胞产物以便除去β-葡聚糖敏感的因子(即凝血因子G)，以及重新构成因子C、因子B和预凝固酶。采用得到的无因子G的体系和凝固酶的合成底物进行Et的特异检测。人们还知道，同时使用Et-敏感的因子(即因子C)和活化的因子C的合成肽底物(例如叔丁氧基羰基-缬氨酰-脯氨酰-精氨酸-对硝基-N-苯胺，以下用Boc-Val-Pro-Arg-PNA表示)作特异的Et检定，参见NakamuraT.等在欧洲生物化学杂志，154，511-521(1986)中所述。此技术也需要分离和提纯的一些复杂操作。

上面提到明鲎检测技术，基于使用部分或全部溶胞产物的液相反应体系。

待分析的样品常常含有干扰鲎试验的各种物质，因而需要作预处理使干扰物质失活或除去。例如，重金属或盐容以高浓度存在时，则会强烈干扰此鲎反应，故不能获知准确的Et水平。在这些情况下，必须用蒸馏水将样品稀释到不产生干扰时为止，但是可以允许的稀释程度受此鲎试验的最低检出限所限制)。此外，还时常遇到这样一些情况，即样品呈混浊或有色状，甚至加以稀释之后仍不能分析。血样或乳样品需要一些复杂的预处理。因此，在这些情况下分析Et涉及有待解决的许多问题。