[发明专利]异硫代伏杀磷的免疫测定法

说明书

本发明涉及利用免疫测定法检测低浓度的异硫代伏杀磷类化合物。

异硫代伏杀磷类化合物在许多存在水和湿气的应用场合广泛地用作生物杀伤剂。在这些应用的许多场合需要测定该系统中异硫代伏杀磷的正确的剂量的稳定性。该技术领域目前的情况是使用高压液相色谱分析法，但这种方法费时、繁琐并且价格昂贵。

1988年3月23日公开的西屋电气公司（Westinghouse    Electric    Coyporation）的欧洲专利申请（申请号为0260829发明人是KEenneth    W.Hanter）公开了可同氯化酚类（尤其是五氯苯酚）反应的单克隆抗体以及产生这些抗体的杂交瘤。还公开了用于检测这些氯化酚类的免疫测定法。虽然许多化合物的检测方法大大地得益于免疫测定法，但是合适的细胞系却很难产生。

美国专利4865972（Hunter）公开了一种以抗体为基础的测定酶诱导化合物[例如二苯并二喔星（dibenlodioxinc）]的方法。异硫代伏杀磷不是酶诱导化合物。

Kohler和MILSTEIN在Nature265;495（1975）中最先描述了针对绵羊红细胞的单克隆抗体是如何通过用肿瘤细胞融合可产生B-淋巴细胞的特定抗体以导致“永生的”自制杂交克隆（或杂交瘤）形成，这种杂交克隆可以在细胞培养物中（试管中）或动物身上（在体内）合成单个的单克隆抗体。

本发明的目的是提出一种经过改进的检测异硫代伏杀磷化合物的方法。

本发明的另一目的是培育一种用于检测异硫代伏杀磷的免疫测定法的细胞系。

这些目的以及从以下公开内容显示出的其他的目的是通过本发明实现的。本发明一方面包括一个新的细胞系，该细胞系能产生可与3-异硫代伏杀磷（尤其是5-氯-2-甲基-3-异硫代伏杀磷）反应的单克隆抗体。本发明还涉及到可和这些异硫代伏杀磷反应的单克隆抗体和多克隆抗体。本发明涉及抗体、制备这些抗体的方法、分析、论断、监测、分离，以及使用这些抗体的其它方法，以及含有用作这种用途的这些抗体的组合物。此外，本发明还涉及可产生单克隆抗体的杂化物以及制备这些杂交瘤的方法。最后，本发明还涉及异硫代伏杀磷和大分子载体的免疫原结合物以及制备这些结合物的方法。

图1表示根据本发明的免疫测定法的异硫代伏杀磷的四个不同种类的结合的抑制百分比。

异硫代伏杀磷作为一个类别是具有1.053×10³mol/秒的与硫醇反应的一级速度常数的强反应亲电试剂（见P.J.cllie等人在J.Appl Bacteriol;69;578-584，1991的文章）。5-氯-2-甲基-3-异硫代伏杀磷还具有在同硫醇类发生开环反应后进一步反应的能力。已知血清和红细胞中含有大量的谷光甘肽（一种被还原的硫醇化合物）。紧接在异硫代伏杀磷被加到牛血清之后无论是用生物测定法、紫外分光光度法或高效液色谱法（Proclin300 product bulletin，Rehm and Haas Company，Philadelphia，PA）都不能检测出异硫代伏杀磷，这意味着异硫代伏杀磷和亲核试剂发生反应并且破坏了完整的环结构。这种用实验说明过的异硫代伏杀磷同血清中已知存在的亲核试剂的快速反应引导人们推测;为了诱导抗体的形成而被注入动物体内的完整的异硫代伏杀磷并不能存活足够长的时间以便和免疫系统的适当组分发生相互作用。因此，完全不能指望可诱导出针对异硫代伏杀磷的抗体。

我们业已发现了一些可以满足许多现有分析技术所不能满足的苛刻要求的新颖的抗体。这样的抗体使得我们可以用各种快速的、简单的、价格合理的免疫测定技术检测生物杀伤剂。这些新颖的抗体用于分析水中的异硫代伏杀磷化合物尤为有效，因为所述异硫代伏杀磷不必被萃取出来。

可以使用多克隆抗体，但使用单克隆抗体更为可取。单克隆抗体是从使得它们具有非常强的特异性和均匀性的B-淋巴细胞无性繁育系（“杂交瘤”）中衍生出来的。这样的杂交瘤实际上是一种自身复制的“工厂”，能潜在地无限地供给单个的、被预先限定了特异性的抗体。

虽然本发明的单克隆抗体的产生是针对5-氯-2-甲基-3-异硫代伏杀磷（“651”），但它也可以和其他异硫代伏杀磷类（例如2-甲基-3-异硫代伏杀磷（“573”）、4，5-二氯-2-n-辛基-3-异硫代伏杀磷（“287”）和2-n-辛基-3-异硫代伏杀磷（“893”）发生交叉反应，如图1所示那样。

用于本发明的异硫代伏杀磷具有如下分子式;