[发明专利]DNA检测法

说明书

本发明涉及一种检测DNA和RNA的方法。

作为检测DNA的方法，PCR（聚合酶链反应）和DNA探针法被广泛使用。前一方法包括通过重复的DNA链聚合酶反应产生目的DNA特定区的大量拷贝，其优点是可以检测微量的DNA（即使起始DNA是一个拷贝，该方法也可应用）。DNA探针法因其步骤简单而具有很广的应用性，但是，为了进一步与非放射性同位素法一起应用，其检测灵敏性有待改进，DNA探针法分为两种方法，一种方法包括将目的DNA进行凝胶电泳并将分离图谱固定在滤纸上，以便通过放射自显影或利用化学发光检测DNA（即Southern印迹法），另一种方法包括未经分离步骤将DNA固定在滤纸上进行检测（点印迹法）。

另一种方法包括将DNA探针与目的DNA在溶液中杂交，然后用荧光等检测DNA。在溶液中进行的该方法很容易实现自动化，因此很有前景。该方法的一个例子是一种利用可与目的DNA杂交的荧光基团标记的探针A和用磁性珠固定的探针B的方法。尽管一般来说探针A和B彼此不反应，但当存在目的DNA时它们则能相互反应（三明治法）。因此，通过测定与探针B反应的探针A，就可定量测定目的DNA。

还有另外一种方法，它包括将两种类型的荧光基团与下面设计的DNA探针结合;当探针处于DNA本身次级构型中的游离状态时，两类荧光基团可被置于彼此靠近的位置，而当DNA探针处于杂交状态时两类荧光基团可彼此公开。当两类荧光基团处于彼此靠近的状态时，激发能量的迁移通过两类荧光基团的反应而发生，而当两类荧光基团分开放量时不发生此种迁移。因此，可通过利用发射光谱随状态的不同而发生的变化来分析杂交探针。

PCR尽管是一种有效方法，但是该方法的缺点在于：对于每一样品DNA，需要两个DNA探针来作为互补伸长的引物，因此需要花费大量劳力来分析各种样品。或者，对于包括检测DNA探针的方法，其灵敏性不能令人满意;或者是该方法不能提供详细信息;或者是用于测定不同的多个DNA区的样品不能被同时检测。

本发明的目的在于提供一种通过使用DNA探针检测的简单方式以高灵敏性检测位于多个区域中的DNA的方法。

为了达到上述目的，本发明的检测方法包括三个方法，第一方法包括将DNA探针杂化在目的DNA上，并通过酶促反应对杂交DNA探针的末端进行不可逆修饰，例如，可通过将被DNA聚合酶进行过化学修饰的核苷酸（不再具有延长互补链的能力）插入末端，或者是通过用连接酶将具有无活性末端基团的低聚物与DNA探针连接来完成这种修饰。

第二方法是切断或除去非反应DNA探针的方法。在该方法中，切断反应是为了切掉未反应的DNA，但该反应并不发生在第一方法中产生的化学修饰过的DNA探针上。例如，在第一方法中，化学修饰的二脱氧核苷酸被加至具有荧光基团标记的5′末端的DNA探针的3′端以封阻3′-末端，然后，用核酸外切酶消化具有未修饰3′末端的DNA探针。

第三方法包括利用磁性珠或可与DNA探针结合的类似物从DNA探针或反应底物的消化产物中分离化学修饰的DNA探针，并通过电泳分离和检测化学修饰的DNA探针。

在利用DNA探针检测靶DNA时，区分“杂交在靶DNA上的DNA探针”与“未杂交的DNA探针”非常重要。按照本发明的方法，杂交DNA探针通过酶促反应进行了末端修饰，然后通过酶促末端消化将具有修饰末端的DNA探针消化成片段。接着，利用长度或DNA杂交能力的不同分离和除去片段，并检测靶DNA。因此，通过这一方法可达到高灵敏检测，同时本底信号被较少抑制。具体地说，在DNA探针处于与靶DNA杂交状态时，通过酶促反应将检测标记如荧光基团引入DNA探针，就可以高灵敏性地检测出靶DNA。

这里，术语“化学修饰”指“将官能基结合至DNA末端或将带有官能基的核苷酸连接至末端，从而抑制作为对低聚核苷酸进行末端消化的酶的核酸外切酶的活性。”

杂交在目的DNA上的DNA探针的长度应为6-mers或更多。如果低于6-mers，杂交可能很不利地基本不发生。由于DNA探针是通过化学合成制备的，从实际角度考虑，为了防止这一制备过程所需时间过长，DNA探针的长度应为40-mers或更低。但是，该长度可能为或可能不为40-mers或更多。寡核苷酸被用作这类，DNA探针。