[发明专利]编码氨甲酰磷酸合成酶Ⅱ的核苷酸序列

说明书

本发明涉及编码恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)的氨甲酰磷酸合成酶II的核苷酸序列，用重组DNA技术生产该酶的方法，以及该序列和酶在治疗学上的用途。

由于对传统药物具有抗性的人疟原虫、主要是恶性疟原虫的演化，目前迫切需要开发新的治疗疟疾的化学治疗剂。对疫苗进行研究似乎是非常可能的替代方法。但是经过多年研究之后，到目前为止尚未有临床可接受的产品。而与此同时，抗蚊媒介昆虫的杀虫剂效力的下降却在增长。目前，多于三分之二的世界人口—约5亿人—被认为生活在疟区(Miller，1989)。在世界卫生组织(WHO)所列世界10种最流行疾病中它排在第8位(每年感染2亿7千万人口)，在10种最致命疾病中排在第9位，每年夺取2百万以上生命(Cox；1991；Marshall，1991)。尽管主要限于贫困国家，但是目前在美国(Marshall，1991)和澳大利亚(Johnson，1991)都有报道，而且旅行者疟疾病例不断增加(Steffen和Behrens，1992)。

疟原虫、恶性疟原虫及其宿主的比较生物化学研究表明许多代谢途径不同。这些区别之一就是该寄生虫仅仅依赖于嘧啶从头合成，因为它不能补救预先形成的嘧啶(Sherman，1979)。而且认为成熟的人血红细胞不需要嘧啶核苷酸(Gero和O′Sullivan，1990)。主要努力方向是开发嘧啶生物合成途径的抑制剂(Hammond等人，1985；Scott等人，1986；Prapunwattana等人，1988；Queen等人，1990；Krunhkrai等人，1992)，进一步证实该途径作为化学治疗位置的可能性。可以预期目前对关键嘧啶酶的分子生物学研究不仅可以作为更好地理解寄生虫生物化学的有效工具，也可以作为探察寄生虫与哺乳动物酶之间具体差异的有效工具。

谷氨酰胺依赖性氨甲酰磷酸合成酶(CSPII，EC 6.3.5.5)催化真核生物的嘧啶从头生物合成途径的第一步定型和限速步骤(Jones，1980)。而且由于它催化涉及三个催化单元和七种底物及中间体这样一个复杂的反应，从生物化学观点来看它是一种非常值得研究的酶。CPSII与其他嘧啶酶的结构关系随不同生物体而改变，这使其成为进行研究的一个好的主题。

可以从疟疾培养物得到的少量原料阻碍了分离足以进行分析量的纯蛋白质。而其固有的不稳定性更增加了纯化CPS的困难。用P.berghei(一种啮齿动物疟疾)粗提物进行研究显示了具有CPS活性的一种高分子量蛋白，据推测它与ATCase有关(Hill等人，1981)，这种状况也发现于酵母中(Makoff和Radford，1978)。然而，Krungkrai及其同事目前的分析(1990)测定了CPSII和ATCase各自在P.berghai中的活性。尽管到目前的研究为止已经在恶性疟原虫中测得了CPS活性(Reyes等人，1982)，但是未指出其大小，也没有指出其在该途径中与其他酶键合。

CPSII的谷氨酰胺依赖性活性可以分成两步：(1)谷氨酰胺酶(GLNase)反应，使谷氨酰胺(Gln)水解并将氨转移至氨甲酰磷酸合成酶的位点；和(2)合成酶反应，在该反应中从两分子三磷酸腺苷(ATP)、碳酸氢盐和氨合成氨甲酰磷酸。第二种活性涉及三部分反应：(a)碳酸氢盐被ATP活化；(b)活化的羧基磷酸与氨反应形成氨甲酸盐；和(c)氨甲酸盐的ATP依赖性磷酰化作用形成氨甲酰磷酸(Powers和Meister，1978)。因此，在CPSII中有两个主要的区，谷氨酰胺的酰胺转移酶区(GAT)和氨甲酰磷酸合成酶区(CPS)或简单合成酶区。谷氨酰胺酶区(GLNase)是GAT的亚区，而在合成酶区中有两个ATP-结合亚区。

考虑到CPS谷氨酰胺的酰胺转移酶区与其他酰胺转移酶之间的相似性，已经提出这些亚单位由表示GLNase区的共同祖代基因(＝20kDa)趋异进化而产生，而且CPS GAT区(＝42kDa，它包括仅存在于CPS中的推断结构区)的特殊进化一定包括其他序列的融合和/或插入(Werner等人，1985)。已经提出该哺乳动物CPSI基因的GAT可以通过在该祖代基因的5’末端与未知基因的简单基因融合来形成(Nyunoya等人，1985)。