[发明专利]原位聚合酶链式反应扩增系统及其容纳装置和安装工具

说明书

本发明主要涉及进行聚合酶链式反应(PCR)的系统，更具体地，涉及在DNA或RNA样品上直接进行PCR而不必将样品从原来的细胞结构中分离的方法及设备。

聚合酶链式反应是一种在热稳定的DNA聚合酶(典型的为Taq聚合酶)，四种DNA核苷酸碱基和二种或更多种单链DNA引物的存在下，通过热循环一个或多个该DNA(模板DNA)的分子的方法制备极其大量双链DNA片段的忠实拷贝的过程(扩增)。这些引物是长度约20碱基的短片段，其碱基顺序与构成双链模板的两条互补DNA单链的5′末端是互补的。

PCR是一种极其有价值而且应用广泛的技术，并且导致了分子生物学领域的革命。该技术在美国专利No.4,683,195、4,683,202和4,965,188中有详细的公开。直至现在，反应是在小的反应管中于溶液中进行的，其中待扩增的DNA是悬浮着的。用于这种过程的设备公开于美国专利No.5,038,852和1992年4月20日提出的美国专利申请No.07/871,274。

最近发现，有可能应用PCR去扩增细胞内的特异的DNA片段，而不必首先将DNA从细胞中抽提出来。该技术叫原位PCR。细胞可以是单细胞，或部分组织样品。在绝大多数情况下，是在显微镜上的载玻片上的细胞或组织薄切片上进行原位PCR的。细胞或组织通常用福尔马林或其他试剂处理而固定，从而保留其形态，便于处理后识别。

如果被选择的DNA片段是以这样的方式扩增的，那么被扩增的产物DNA就能被选择性地染色，其后对PCR处理过的细胞显微镜检查就能鉴别出组织样品中含有特定的DNA片段(甚至在细胞内仅局限存在)的那一种细胞(如果存在的话)。如果存在的话使细胞中的扩增DNA变得可见可以通过两种方法中的任一种达到。一种方法是使用互补的单链DNA探针，探针上附着有标记分子。该探针会与扩增样品中特异DNA顺序(如果存在的话)杂交，多余的探针和标记物被洗去。接着留有标记分子的部位通过显影剂处理而变得可见。这种使之可见的技术叫“原位杂交”，或原位扩增DNA的“间接测定”。

另一种使之可见的方法是在PCR过程中，使用包括附着有标记分子的经修饰的DNA核苷酸碱基在内的PCR试剂。许多携带标记分子的经修饰的碱基会通过DNA聚合酶直接掺入扩增产物。接着与前面一样用显影剂处理载玻片，便使扩增DNA的部位置变得可见了。这种技术叫原位扩增DNA的“直接掺入测定”。

在两种方法中，典型地，显影剂包括偶合于某分子的上一种酶，例如碱性磷酸酶，该分子牢固和特异地与扩增DNA或杂交探针上的标记分子结合；以及一种底物，酶可以将其转变成不溶的，强吸收的染料。如果扩增DNA上的标记分子是生物素，那么典型的与酶偶合的结合分子是抗生物素蛋白。如果标记分子是地高辛，那么结合分子是抗-地高辛抗体。两类显影剂都已用于两种原位杂交的间接测定和直接掺入测定。标记分子上的标记物可以是显色性，荧光性或放射性的。

测定原位扩增DNA的两种方法都是非常敏感的，能测到每个细胞中10～几百个扩增DNA片段的拷贝。两种方法都需要在原位PCR热循环结束之后进行某些载玻片的PCR后处理。

完整细胞的原位PCR的热循环方法因细胞来源的不同而有差异。不形成组织的细胞，例如白细胞和多种培养细胞(如HeLa细胞)，并不一定需要特殊的仪器操作来进行原位PCR循环。Hasse等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,4971-4975(1990)，报导，这样的固定细胞的悬浮液可以在正常用于液相PCR的相同反应管中进行热循环，然后，细胞涂布于载玻片上以便测定扩增产物。

然而，更常用是这样的细胞可以在载玻片上进行热循环。它们通过离心涂布于载玻片上，产生所谓的“细胞旋转”(cytospin)制备物。使细胞涂布有助于固定方法及其他前PCR样品处理。这并不需要额外多费功夫，因为否则的话为了使载玻片上的扩增产物变得可见，细胞旋转步骤在随后也是必需的。细胞旋转与载玻片上的组织一样，被扩增。

当待研究的是组织切片中的细胞时，它们必须被直接在表面上扩增，因为否则的话，薄切片将不能显示组织的形态。与这些组织的热循环相关的主要问题在于维持组织形态以及细胞形态，抑制样品上的PCR反应混合物的蒸发，以及获得均一的，重复性高的结果。