[发明专利]产生交叉反应物质蛋白和白喉毒素的新型质粒

说明书

CRM 197蛋白是白喉毒素的无毒形式，但在免疫上与白喉毒素难以区别。CRM 197是由不产生毒物的噬菌体β197^tox-感染的白喉棒状杆菌（即白喉杆菌）产生的，而β197^tox-是通过用亚硝基胍使产生毒物的β棒状噬菌体发生突变而产生的（Uchida，T.et al，1971，Nature New Biology 233：8-11）。CRM 197蛋白与白喉毒素的分子量相同但是在结构基因中的一个碱基的改变（鸟嘌呤变为腺嘌呤）造成了两者的差别。这个单一的碱基改变在成熟蛋白质中造成了氨基酸的替代（谷氨酸替代甘氨酸）并因此消除了白喉毒素的毒性。CRM 197蛋白是安全而有效的依赖T-细胞的糖类载体，目前用于B型流感嗜血杆菌寡糖CRM 197结合疫苗（Hib Titer^TM;Lederle Praxis Biologilacl，Rochester，N.Y）。

大量生产用于疫苗的CRM 197蛋白因为蛋白来源不丰富而受到阻碍。人们已发展了使用双溶源非产毒棒状噬菌体β197的支持生产CRM蛋白的技术。（Rappuoli，R.，1983Applied Env.Microbio.46：560-564;U.S.Patent 4，925，792issued to R.Rappuoli;and Rappuoli，R.，1983，J.Bacteriol.153：1202-1210）。Rappuoli报导，用双溶源噬菌体得到的CRM 197的产量是使用单溶源的三倍。用单溶源噬菌体时CRM 197的生产水平是充足的，但是用于采用CRM 197蛋白生产疫苗在经济上是不能令人满意的。

将多重溶源的棒状噬菌体β引入白喉杆菌，鉴别出能过量产生CRM 197蛋白、白喉毒素或其他能与白喉毒素交叉反应的CRM蛋白的菌株，是一个费力的筛选过程。此外，这种方法在应用标准的重组技术进行蛋白表达操作的能力方面存在局限。因此，发展通过增加基因拷贝数目而不使用β棒状噬菌体，或者通过增加β棒状噬菌体溶源的菌株中的这些蛋白产量，从而产生大量的白喉毒素和CRM蛋白的方法是大有益处的。

本发明涉及用于操作和引入编码CRM 197、白喉毒素以及其他从白喉毒素基因衍变而来的CRM蛋白的基因的新方法和新的质粒系统，以及用这些手段转化的微生物。描述了一种特别优选的DNA质粒，名为pPX3511，它将来自非产毒的β噬菌体的CRM 197基因与质粒pNG2-22结合在一起。新的质粒系统能将白喉杆菌菌株转化为能高水平表达CRM 197蛋白而不需使用多重溶源的菌株。本发明提供了一种精巧手段，用于增加CRM 197，白喉毒素以及其他从白喉毒素基因衍生而来的CRM蛋白的表达。基因表达也可以通过增加启动子的强度或者解除启动子铁调节而加以操纵。在优选实施例中，质粒系统能用来表达与CRM 197，白喉毒素或其他从白喉毒素基因衍生而来的CRM蛋白在遗传上融合在一起的其他蛋白质。来自CRM 197，白喉毒素或其他从白喉毒素衍生而来的CRM蛋白质的调控和加工顺序能用于在棒状杆菌（Corynebacterium spp.）中表达外源蛋白。

图1是命名为pPX3511的重组DNA质粒，它含有CRM 197基因，从大肠杆菌克隆载体pUC18衍生而来的多克隆位点，其中含有氯霉素抗性（CmR）标记基因以及从质量pNG2-22衍生而来的复制起点（Serwold Davis，T.M.et al.，1990，FEM Microbiol.Lett..66：119-124）。

图2是12%的SDS-PAGE凝胶电脉图。它显示了白喉杆菌C7不同菌株所产生的CRM 197（61.8千道尔顿）。A道：高分子量标准（BRL，200-14.3千道尔顿）;B道：单溶源C7（β197）^tox-;C道：双溶源C7（β197）^tox-;D道：非溶源性C7（β197）^tox-和pPX3511，在不存在氯毒素（Cm2）（2μg/ml）下生长;E道：非溶源性C7（-）^tox-和pPX3511，在氯霉素（2μg/ml）下生长;F道：单溶源C7（β197）^tox-和pPX3511，在不存在氯毒素下生长（2μg/ml）;道G：单溶源C7（β197）^tox-，在氯毒素下生长（2μg/ml）。