[发明专利]心肌细胞生长刺激肽的制备方法

说明书

本发明涉及的是心肌细胞生长刺激肽(CMGSP)技术领域。

一般具有刺激心肌细胞DNA合成和蛋白合成，促进其分裂增殖的细胞因子，是从自发性高血压大鼠或实验性高血压动物的心肌中提取。据文献介绍：尚有NaganoM等人、Subha S等人进行此项研究。其共同特点是心生长因子(CGF)的提取均用病理性高血压动物心肌。

本发明的目的在于提供一种从健康的幼年哺乳动物的心肌中，制备出一种具有较高的生物活性的CMGSP的方法，并采用特异的冷冻干燥曲线(方法)，将CMGSP冻干，使其可较长期保持活性。

本发明的目的可通过以下技术措施来达到，选取健康的幼年哺乳动物心脏，采用任何机械方式，将其捣碎-20℃深冻-融解后加热60-100℃,15分钟-恢复至室温后再-20℃深冻-融解后，离心3000rpm，30分钟-上清液进负压截留柱-除菌-分装-冻干-包装

本发明的目的还可以通过以下技术措施来达到：截留柱系采用中空纤维超滤柱，其截留分子量≤20000Da，负压在0.5×10⁴Pa，超滤柱组合方式可为单一柱或多柱串联使用；制备的心肌细胞生长刺激肽(CMGSP)活性保持冷冻干燥是：加入3-8％甘露，-40℃速冻维持2小时30分钟后，于半小时内升温至0℃，持续3小时，然后在1小时内升温至37-38℃，维持20小时。

冻融方法可重复1至数次。

本发明制备的(CMGSP)具有较高的生物活性，表现生物活性方法：取SD胚胎鼠(孕12-16天)，无菌分离心脏，胰蛋白酶分离心肌细胞，用DMEM培养基洗涤3次后，用含10％小牛血清的DME/F12培养基配制2-5×10⁵个细胞/ml，置96孔培养板内，每孔0.15ml,37℃,5％CO₂条件下孵育24小时。用无血清DME/F12培养基换液后，实验孔加入5-40μg/孔的CMGSP，对照孔仅加DME/F12培养基，继续培养48小时，每孔加入5μ IMTT(1.5mg/ml,DME培养基配制)，继续培养4-6小时，每孔加入二甲基亚砜100μl终止反应置酶标仪570nm条件下测OD值，以实验孔/对照孔＞1.7倍为有活性。测定结果如下：

CMGSP对培养中心肌细胞线粒体脱氢酶活力的影响

       N          OD         倍数         P值

对照组 8      0.108±0.01

实验组(μg)

5    4        0.143±0.02     1.3         ＞0.05

10   4        0.233±0.03     2.2         ＜0.01

20   4        0.243±0.02     2.3         ＜0.01

40   4        0.195±0.04     1.8         ＜0.05

本发明制备的CMGSP的药理作用明显，心肌细胞环死数量少，淋巴细胞浸润程度轻，心肌细胞结构清晰。

本发明制备的心肌细胞生长刺激肽(CMGSP)的健康的幼年哺乳类动物选自猪、牛、马、羊、狗、兔等。

本发明制备的心肌细胞生长刺激肽(CMGSP)可制成口服药和肌肉注射，或其它药物配伍静脉滴入给药。

本发明实施：1．将心肌细胞生长刺激肽(CMGSP)液体加入3-8％甘露分装5ml药用易新析安瓿中，每瓶5ml液体，-40℃速冻维持2.5小时，半小时内提高温度至0℃，持续3小时，然后在1小时内提高温度至37-38℃，维持20小时。

冻干为5ml药用易析安瓿，也适合于其它5-10ml药用管子瓶或模子瓶。