[发明专利]用于内毒素测定的试剂以及使用该试剂进行测定的方法

说明书

本发明涉及一种用于内毒素测定的试剂、一种用于内毒素测定的药盒、一种进行内毒素测定的方法、一种用于预处理样品的载体、一种抑制G因子激活的方法以及一种G因子激活抑制剂，其中使用了鲎血液变形细胞溶解物试剂。

利用鲎血液变形细胞溶解物（本文此处以后简称为“溶解物”）进行内毒素测定（本文此处以后称为“Et”）的方法被人们熟称为鲎试验。由溶解物的反应构成的该测定称为鲎反应。鲎试验灵敏度很高，已广泛用于对药物和水的致热原检测、诊断用途等等。鲎试验是建立在在痕量内毒素存在的情况下溶解物凝集的基础之上的。最新的生化研究已经阐明鲎试验是由数种凝集因子逐步激活所构成的事实（J.Protein Chem，5，255-268（1986））。

下面参考图1，以鲎（Tachypleus Tridentatus）的溶解物说明鲎反应。当内毒素加至溶解物中后，溶解物中的C因子（一种对内毒素敏感的因子，分子量：123，000）被激活。激活的C因子局限地在特异位点水解B因子（分子量：64，000），产生激活的B因子。已激活的B因子激活前凝固酶（分子量：54，000）使其转化为凝固酶。凝固酶在环袢中由二硫键交联的特异位点上局限地水解凝固蛋白原（coagulogen）（促凝蛋白质;分子量：19，723），即在…Arg¹⁸与Thr¹⁹…之间和…Arg⁴⁶与Gly⁴⁷…之间水解，释放相当于H-Thr¹⁹……Arg⁴⁶-OH的C肽（28个氨基酸残基）并将剩余部分转化成凝固活素凝胶。因而，鲎反应是由一系列反应组成的（由内毒素引起的级联反应本文此处以后称为C因子系统反应）。

上述的溶解物级联反应不仅由内毒素引起，也由（1→3）-β-D-葡聚糖（本文此处以后称为β-葡聚糖）引起，即，图1中的G因子（β-葡聚糖敏感因子）被β-葡聚糖激活，激活后的G因子将前凝固酶转化为凝固酶，凝固酶以前述的内毒素同样的方法作用于凝固蛋白原，产生凝固素凝胶（由β-葡聚糖引起的级联反应本文此处以后称为G因子系统反应）。

通过级联反应产生的凝固酶也能水解另外加入到反应系统中的合成肽底物的酰胺键，这种底物如叔丁氧羰基-亮氨酰-甘氨酰-精氨酸-对硝苯胺（Boc-Leu-Gly-Arg-pNA），水解后释放对硝苯胺。因而，借助测定所释放的对硝苯胺的吸收值可以定量测定内毒素或β-葡聚糖。

由于一般使用的溶解物含有有关C因子和G因子系统反应中的成分，因此将它用于测定样本中内毒素有时会得到不精确的结果，因为样本中可能含有的β-葡聚糖激发了G因子系统反应。

所以，鲎试验已被证明对内毒素测定是非特异性的，已用许多尝试试图发展一种内毒素特异性测定的方法。例如，已报导的一种方法为借助使用只含C因子系统反应相关成分的溶解物馏分可以有效地进行内毒素特异性测定（Obayashi T.et al.，Clin.Chim. Acta，149，55-65（1985））。

然而，该方法需要极其复杂的操作以制备无G因子系统，包括用含固定其上的葡聚糖硫酸盐的亲和载体进行亲和层析，使溶解物分馏从而消除β-葡聚糖敏感因子即G因子，以及重建用于内毒素特异性测定的C因子、B因子和前凝固酶。

另一方面，已知所有这些涉及鲎反应（C因子和G因子系统反应）的激活因子均为丝氨酸蛋白酶，并且鲎试验在其它的丝氨酸蛋白酶存在时会产生假阳性而无论Et和β-D-葡聚糖是否存在，这些丝氨酸蛋白酶如胰蛋白酶和凝血酶，它们可以通过其限制性水解将凝固蛋白原转化为凝固活素凝胶或水解上述合成底物（Harada T.et al.，J. Med. Enzymol.，3，43-60（1978））。因此，目前应用鲎试验不可能测定含丝氨酸蛋白酶样品中的内毒素。

本发明的第一目的在于应用一种溶解物试剂，通过避免溶解物所含的β-葡聚糖敏感因子（G因子）的影响而只基于C因子系统反应特异性地测定样本中的内毒素。

本发明的第二目的在于应用一种溶解物试剂，通过特异性抑制样品中丝氨酸蛋白酶活性但不抑制溶解物中C因子系统反应所涉及的激活因子的活性排除假阳性反应，从而准确测定含丝氨酸蛋白酶样品中的内毒素。