[发明专利]用PQQ-依赖性脱氢酶比色测定分析物的方法

说明书

本发明涉及在富电子芳族亚硝基化合物类电子受体存在下通过用PQQ-依赖性脱氢酶的酶促氧化进行比色测定分析物，以及通过颜色形成比色测定还原的电子受体用以测量分析物的量的方法。此外，本发明涉及通过酶促氧化比色测定分析物的试剂，所述试剂含有PQQ-依赖性脱氢酶、富电子芳族亚硝基化合物以及对于该富电子芳族亚硝基化合物还原形成的亚氨基化合物来说形成颜色的非氧化检测试剂。另外，本发明涉及新的亚硝基苯胺类化合物，其制备以及其用于比色酶促测定分析物的用途。

在分析方法中，酶促氧化作用使检测和测定各种样品材料中的物质成为可能。在此情况下，氧化酶在接受氧化反应的电子的受体存在下作用于合适的酶底物。电子受体的还原表明存在酶底物。在这一点上，已经证实了当还原的电子受体能通过颜色形成而被检测时是特别有利的，因为其不是必需仅仅借助于昂贵的测量装置，而是也可以根据需要目视进行。

已知的借助具有氧化作用的酶比色测定底物的方法使用氧化酶或脱氢酶。这两组酶均属于氧化还原酶大类（“Roempps Chemielexikon，Francksche Ver lagsbuchhandlung，Stuttgart”，第8版，1985，第4卷，第2952页;“Lexikon Biochemie，Publisher H.D.Jakubke，“Verlag Chemie，Weinheim”，第2版，1981，第194页），根据其天然电子受体其成员可以被区别。

氧化酶的天然电子受体是分子氧（“Roempps Chemielexikon，Francksche Ver lagsbuchhandlung，Stuttgart”，第8版，1985，第4卷，第2946页;）。在分析物测定中，分析物被此方法中的氧化酶和O₂氧化。形成的H₂O₂用于帮助过氧化物酶氧化无色染料。作为使用氧化酶比色测定分析物的现有技术状况的代表，引用A.Kunst等人的Methods in enzymatic analysis，Publ.H.U.Bergmeyer，“Verlag Chemie，Weinheim”，第3版，1984，第6卷，第178～185页。在此参考文献中，通过用葡萄糖氧化酶和大气氧在水溶液中反应，检测血清、血浆或去蛋白血液中的葡萄糖，其中在该反应中由于氧还原而形成的过氧化氢在过氧化物酶存在下被还原并借此作用于均存在于反应混合物中的酚和4-氨基非那宗以形成颜色。H₂O₂高的氧化还原电势和过氧化物酶的非选择性及不稳定性经常导致这些试验受到限制。例如过渡金属离子或血红素或血蛋白（如那些易于在血样中发现的）会干扰试验，因为它们分解过氧化氢。样品中的成分例如胆红素和药物例如甲基多巴（它们实际上可在血样或尿样中发现）会导致与过氧化氢和过氧化物酶形成颜色，因而得出假的结果;它们也可以还原并因而漂白已经形成的颜色。

氧化酶对氧的需求还证实了其另外的缺点，特别是当在固体载体上进行所谓的干法试验的上述测定方法时。氧从空气中扩散至反应基质中可以成为速度决定性步骤，尤其是当需要大量的氧以氧化高浓度酶底物时，这就导致了反应时间长或得出假的结果，尤其是在动态测定方法中。

脱氢酶一般可以分成两类，一类需要辅酶Ⅰ（NAD）或辅酶Ⅱ（NADP）作为氧化酶底物的天然直接电子受体，另一类是非NAD依赖性或非NADP依赖性的并因而使用其他底物作为酶促氧化反应中的天然直接电子受体。具体地讲，PQQ依赖性和黄素依赖性脱氢酶是非NAD依赖性或非NADP依赖性脱氢酶中的一部分。

用NAD依赖性脱氢酶进行比色测定是已知的，例如参见DE-A-2147466。该申请描述了乳酸脱氢酶催化乳酸和辅酶Ⅰ转化成丙酮酸和还原型辅酶Ⅰ，所形成的还原型辅酶Ⅰ（NADH）例如在心肌黄酶存在下与四唑鎓盐反应，生成NAD和有色的甲类化合物，该甲的浓度可进行光度测定。还提及了用N-甲硫酸N-甲基吩嗪鎓（N-Methylphenazinium methosulfate）代替心肌黄酶作为将NADH的电子转移至四唑鎓盐上的还原催化剂。

该方法的缺点在于，除了NADH之外，在非特异性还原催化剂如心肌黄酶或N-甲硫酸N-甲基吩嗪鎓存在下，其他具有还原作用的底物如谷胱甘肽或药物如甲基多巴或dobesylate（它们可在生物样品例如血液、血清、血浆或尿中发现）也可将四唑鎓盐转化成相应的甲类化合物，因而导致假阳性结果，尽管它们在不存在还原催化剂时不会与四唑鎓盐迅速反应。