[发明专利]脑蛋白水解物

说明书

本发明涉及一种从动物，特别是猪脑中提取脑蛋白水解物的方法，本发明还涉及所述脑蛋白水解物的注射液及其制备方法。

脑蛋白水解物最早由奥地利EBEWE药厂以Cerebrolysin为商品名出售，其中含有多种人体必需的氨基酸以及非必需氨基酸，并且含有分子量为10,000或更低的肽。尽管其应用早已公开(参见EP452299)，但是其提取方法至今未见报道。

本发明的目的在于提供一种从动物脑、尤其是猪脑中提取脑蛋白水解物(下文简称为“脑乐”)的方法。

本发明的另一个目的是提供制备脑乐注射液的方法。

下文将详细说明本发明的目的

图1概括了脑乐的提取方法及制备成注射液的方法；

图2为进口脑活素注射液对照品肽含量HPLC色谱图；

图3为进口脑活素201468肽含量HPLC色谱图；

图4为进口脑活素901724肽含量HPLC色谱图；

图5为进口脑活素912950肽含量HPLC色谱图；

图6为脑乐注射液930401肽含量HPLC色谱图；

图7为脑乐注射液930402肽含量HPLC色谱图；

图8为脑乐注射液930403肽含量HPLC色谱图；

图9为脑活素肽II(MW5270)纯品HPLC色谱图；

图10为脑活素肽I(MW1770)纯品HPLC色谱图。

本文所述的脑乐注射液是通过以下过程制备的：(1)匀浆：将新鲜猪脑去脑膜脂肪，剪成小块，于匀浆机   中匀浆，重复一次，得脑匀浆液；(2)脱脂：将脑匀浆液倒入带盖缸中，边搅拌边加入冷丙   酮，然后于4℃放置4小时后，倾去上清液，重复2-3次，   将沉淀物倒入瓷盘中，置通风橱吹干，研磨成粉，过   筛，得脱脂干脑粉；(3)水解：取干脑粉，加酶液，置37℃水浴保温8小时，然   后离心，弃去沉淀物，得到水解液；(4)浓缩：将水解液用旋转薄膜蒸发器浓缩；(5)离心：浓缩液用冷冻、高速、大容量离心机离心   (10000-20000rpm)，取上清液；(6)超滤：离心后的上清液经超滤器一万分子量截留膜超   滤，得到棕黄色澄明溶液；(7)精制：将超滤后的溶液经DEAE-Sephadex A-25柱色谱   分离，用Tris-HCl缓冲液和含NaCl的缓冲液洗脱，用   紫外分光光度计监测，并收集各主峰馏分，得精制清   液；(8)灭菌：将所得精制清液灭菌，得无菌注射液。实施例：

取新鲜猪脑，去脑膜脂肪，剪成小块，于匀浆机中两次匀浆。将匀浆液倒入带盖缸中，边搅拌边加入冷丙酮，然后于4℃放置4小时，倾去上清液，重复此过程两次。将沉淀物倒入瓷盘中，置通风橱中吹干，研磨成粉，过筛，得脱脂干脑粉。向干脑粉中加入酶液，于37℃水浴中保温8小时，然后离心，弃去沉淀，得水解液。用旋转薄膜蒸发器浓缩水解液。将浓缩液于冷冻、高速、大容量离心机上离心(15000rpm)，取上清液。将离心后的上清液经超滤器一万分子量截留膜超滤，得棕黄色澄明溶液。所得溶液经DEAE-Sephadex A-25柱色谱分离，方法如下：(1)配制Tris-HCl缓冲液，作为基础缓冲液；向部分基础   缓冲液中加入NaCl，作为洗脱液。(2)装DEAE-Sephadex A-25柱(5×120cm)，DEAE   -Sephadex A-25预先用Tris-HCl基础缓冲液浸泡1-2天，   装柱后用基础缓冲液平衡。(3)将超滤完的溶液用吸管缓缓加入层析柱的上面，待样   品渗入胶中加少许基础缓冲液，然后封柱，启动恒流   泵，控制流速为60ml/小时，每次上样6克。(4)用洗脱液与基础缓冲液，在梯度仪容量瓶中进行梯度   洗脱。(5)流出液经紫外分光光度仪测定并绘出光密度与管数的   吸收曲线，收集各主峰馏分。(6)经HPLC凝胶柱分离该样品的肽成分，得到国内外均未   报道的二个肽成分，其含量超过90％。所得馏分经灭   菌制成无菌注射液。分析方法如下：一、样品：奥地利依比威大药厂  批号：901724，

912950。

本研制样品批号：930401，930402，930403。

中国药品生物制品检定所生化药品室脑活素肽I及

肽II HPLC纯标准品二、方法：HPLC凝胶过滤法

1、试剂：磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、异丙醇。

2、仪器：Waters HPLC，510型泵，481型检测器、

   740型数据处理器。

3、色谱分析条件：流动相为0.1M(PH＝7)的磷酸盐