[发明专利]从苏云金芽孢杆菌中鉴定、定量和纯化杀昆虫蛋白质

说明书

本发明涉及从苏云金芽孢杆菌中，特别是苏云金芽孢杆菌的多基因菌株中鉴定、定量和纯化杀昆虫蛋白质。

苏云金芽孢杆菌(以下简称Bt)是一种革兰氏阳性土壤细菌，特征在于它能够在孢子形成期间产生大的结晶多分孢子包含物。这些包含物由表现出高特异性杀昆虫活性的蛋白质(前毒素)组成。

它鉴定了许多有不同昆虫宿主毒性谱的Bt菌株。许多菌株都有抗鳞翅目中某些成员之幼虫的活性(迄今已鉴定了有抗100种以上鳞翅昆虫活性的Bt菌株)，但显示对双翅或鞘翅目昆虫有毒性的菌株也是已知的。

已证明Bt多分孢子包含物是一种有价值的常规杀昆虫剂代用品。它们对靶昆虫有高度毒性，而且由于它们的特异性而对环境无害。其他昆虫目、动物和植物似乎不受该毒性结晶蛋白质的影响。二十多年前就已使用各种Bt的配方作为生物学杀昆虫剂，以控制农业和森林害虫，并在近年来用以控制各种人和动物疾病的昆虫载体。

Bt产生几种类型的毒素，其确切生物化学性质可因菌株不同而不同。其中有些，特别是α和β外毒素，对各种昆虫目或许多细胞类型有毒性。多分孢子结晶包含物毒素(也称为δ内毒素)，其为蛋白质，具有更有限的和特异性的宿主范围。当被幼虫吞噬时，Bt结晶包含物溶解在幼虫中肠中并在幼虫中肠中迅速受到蛋白水解，转化成较小的毒性多肽(分子量范围为23-80KD)。所产生的毒素与宿主昆虫的中肠上皮细胞相互作用，在细胞膜中产生孔隙并破坏渗透压平衡。上皮细胞肿胀并溶解。幼虫停止摄食并最终死亡。已证明敏感昆虫的中肠上皮细胞上存在几种Bt毒素的特异性高亲和性结合位点，这一事实可解释这些毒素的高度特异性。

近几年逐渐明确，Bt备有特别大的和可变的杀昆虫蛋白质家族。使用几种实验方法得到的数据表明许多对鳞翅昆虫有毒性的Bt亚种中的结晶蛋白质基因位于一个或多个大的质粒上；在某些亚种中，该基因可被定位在染色体上。Bt前毒素的基因通常是质粒装载的这一事实已使Bt成为基因操作的适用候选物。其中包括，最年已导致产生能够表达Bt结晶蛋白质基因的昆虫抗性转基因农作物。

另外，近年也已了解到，许多Bt菌株含有编码前毒素的几个密切相关的基因。例如Bt变种Kurstaki NRD-12菌株即是三基因菌株。几个这样的基因的存在导致由单—Bt菌株产生几种其氨基酸序列密切相关的前毒素。蛋白水解酶在体外或在昆虫中肠内对这些前毒素混合物的酶促作用，产生几种只是少数几个氨基酸残基有所不同的毒素，从而使所得到的毒素混合物难以分离。然而，因为这些小的差异常常是出现在毒素序列的关键区域，所以它们可能造成对所选择的昆虫靶有明显不同的毒性。因为由Bt的多基因菌株所产生的毒素混合物的组合和个别毒素的表达水平可随着发酵条件而变化，所以其对各种昆虫的相对毒性就可能不同，而且作为一种结果，多基因Bt菌株的宿主范围也有所差异。因此，为了从多基因生产菌最佳化生产最想要的毒素，监测并定量存在于内毒素结晶中的不同毒素就变得十分重要。

从Bt的各个菌株的δ-内毒素中纯化杀昆虫毒素的各种尝试是现存技术中已知的。所提出的典型方法包括用蛋白水解酶如胰蛋白酶或昆虫消化液消化Bt的结晶包含物，然后用各种分析方法，如电泳法、凝胶过滤法和离子交换层析法分离水解产物。然而，这些方法都不能分离和纯化从Bt的多基因菌株中得到的密切相关的毒素。

同样，也提出了Bt菌株的许多定性的定量特征。例如包括使用鞭毛抗体，用DNA探针检查基因或检测RNA产生的水平。虽然这些方法可用于确性特征和分类目的，但对于定量基因表达和监测给定菌株的存活性，或生产用于分析杀昆虫活性、协同作用、膜研究或昆虫抗性的个别毒素标准品来说是不能令人满足的。

具体地说，Fullmer，C.B.和Wasserman，R.H.〔Analytical Peptide Mapping by High Perform-ance Liquid Chromatograpwy(应用于小肠钙结合蛋白质〕，J.Biol.Chem.254，7208-7212(1979)〕描述了一种包括彻底酶促消化以提供肽混合物的肽酶切图技术。用反相HPLC，结合使用酸和有机溶剂对肽混合物进行分析。