[发明专利]用哺乳动物生产人血液蛋白质

说明书

本发明涉及医药领域和生物技术领域，具体地说涉及医用生物制品——人血浆代用品、血液代用品及血液活性因子的生产技术。

一个世纪前，人们认识到，大量失血致死的原因主要是由于循环血量的减少，而不是红细胞的不足，从而采用了生理盐水治疗急性失血后的休克。同时，也促进了血浆代用品的发展。

近年来，由于输血对血液需求的迅速增长，而血液供应却远不能满足需要，且从各个人体获得的血液存在着引入爱滋病或其他致病原的危险。同时，输全血不仅不经济，而且从效果上来看也无必要。尤其在战争时期，大批伤员待处理，往往易发生血型错配和输血后的血清性肝炎。另外，烧伤病人输入过多全血反而会增加其心脏负担，而慢性贫血病人输入红细胞浓缩液即可达到目的。因此，人血液或血浆代用品的开发无论和平时期还是战时都具重大意义。

近年来生物医学研究结果还表明，人血液中还含有许多调节人体机能的活性蛋白。如抗血友病的凝血因子、凝血酶原、纤维蛋白原、铜蓝蛋白、特铁蛋白，以及各种免疫球蛋白。这些蛋白质在临床上，也有着重要的应用，而仅从人血液中提取远不能满足临床需要。

目前，主要的血浆代用品有右旋酐、明胶、羟乙基淀粉及变性动物血清。然而，这些代用品都存在很大的缺点或不足，还不能完全代替人类白蛋白和人血浆。右旋糖酐常使血管脆性增加，出血时间延长，引起变态反应，促发充血性心衰或肺水肿的可能，导致肾小管阻塞，肾功能衰竭病人不能用。明胶制品也有导致过敏性休克发生的危险。羟乙基淀粉代血浆输注后的反应，虽比中分子右旋糖酐少，但仍有创面出血现象。而变性动物血清也存在导致手术创面流血及残留动物血清抗原的问题。

理想的血液代用品应是无基质血红蛋白溶液，但是目前无基质血红蛋白仍只能由血浆生产剩余的血红细胞或血库中过期血液的红细胞制备。因而也不能大量制备，存在来源紧缺的问题。

血液中活性细胞因子在血液中含量很低，更不能从人血中提取以满足日益增长的临床需要。

近年来发展起来的基因工程技术为工业生产理想的人血液代用品、血浆代用品及血液活性因子提供了有效高产的生产技术。

结合基因重组技术和动物胚胎体外操作技术，发展出将外源基因转入动物体内的技术。一般而言，通过基因重组技术可以获得所要的蛋白产品的编码基因，并与适当的表达序列重组，然后通过哺乳动物胚胎体外操作技术将外源基因导入动物胚胎内，并把这些胚胎移入母体内使之继续发育至产仔。具体地说，包括以下步骤：(1)分离编码目的蛋白的基因，并进行重组；(2)收集动物受精卵；(3)将重组基因导入动物受精卵；(4)将转移入外源基因的胚胎移入假孕母体内，子代出生后，取其少部分组织制备DNA，用探针进行杂交，以检测外源基因的整合状况。

上述方法已被用于将外源生物生长激素基困转移入小鼠体内，并获得表达。然而在大动物生产人血液蛋白质方面尚未获得成功。

本发明的目的是提供一种高效生产人类血液蛋白的方法，克服上述方法中一个或多个不足和/或缺陷。

根据本发明的方法，其主要步骤包括：

1.分离编码人类血液蛋白质的基因，构建适当的表达重组基因；

2.收集动物胚胎；

3.通过直接或间接的方法，将重组目的基因导入动物胚胎；

4.培养导入重组基因的胚胎，或将其移植入经假孕处理的母体内；

5.子代出生后，取少量组织，通常是不太重要的部位，如尾部，制备DNA，进行PCR扩增，探针杂交或印迹，以确定外源基因是否已整合入动物基因组；同时检测子代体内目的蛋白的含量；

6.整合表达重组基因的子代长成成体后，取其血液提取血液蛋白。

人血液蛋白质主要指血红蛋白、白蛋白、C-蛋白、纤维蛋白原、转铁蛋白、铜蓝蛋白，调理素蛋白、各种免疫球蛋白、凝血酶原和凝血因子。

动物胚胎可以是成熟卵子、受精卵或附植前任一时期的胚胎。动物可以是任何非人哺乳动物，适当的动物包括猪、羊、牛、兔，动物胚胎的收集可根据现有方法进行。

导入重组基因的直接方法：包括显微注射法、电脉冲介导法、病毒载体转染法、脂质体或原生质体融合法，间接方法包括经原生殖细胞、精子载体法、胚细胞或胚胎干细胞嵌合法。可根据所具备的条件选择适宜的导入方法。

假孕母体指与胚胎来源同种的成年雌性动物，经外源激素进行同期发情处理。可根据现有方法处理成年雌性动物，使之同期发情。