[发明专利]脱氧核糖核酸(DNA)提取工艺

说明书

本发明涉及脱氧核糖核酸的提取工艺，进一步涉及从鱼性腺如精巢提取脱氧核糖核酸（DNA）的工艺。

脱氧核糖核酸（Deoxytihonucleic    acid-简写DNA）是人体和生物体的主要遗传物质，它对生物的生长、发育、遗传、变异、代谢等生命活动，起着控制作用。

脱氧核糖核酸产品，应用谱极广除用作生化试剂，提取核苷酸等原料外，在医药保健，农业作物以及食品美容等方面均产生相当显著的作用，因此一直都列为国内外重大科研项目，吸引研究者们不辞辛劳地耕耘。

二十世纪初，研究人员只能从蛙鱼和鲱鱼的精巢中，采用化学方法在实验室里进行微量提取，稍后又发现了可从小牛的胸腺中提取;目前国内外相继发明了从海产鱼精巢中提取DNA的技术，这些技术大多借助化学方法完成，然而化学方法的弊端则不言而喻。

苏联专利SU652187和日本专利J55015449相继披露了从鱼的性腺组织体内提取DNA的技术，前者用的是生化提取法，后者用的是化学提取法。然而前者用的生化提取法是采用胰蛋白酶或链霉蛋白酶进行处理，成本高，来源少，且工序复杂，只能在实验室中少量提取，未形成大规模生产，况且用生物化学方法从淡水鲤鱼精巢中提取DNA，讫今国内外尚无报导。

本发明的目的在于：

1、扩大DNA的生产规模，广泛取材，从各类鱼的性腺组织如鱼精巢提取之，进而避化学提取法之弊端，扬生化提取法之优点，减少环境污染。

2、简化工艺，缩短生产时间，提高提取率。

本发明的技术方案如下：

取鱼精巢（淡水海水鱼均可）作原料，因精巢中的精原细胞含有大量DNA，精巢本身又含有脱氧核糖核酸酶（DNase），加工过程中加入柠檬酸钠，抑制DNase的活性，使精巢中的DNA不被其本身的DNase所水解。采用酶水解蛋白质，使之与DNA脱离，在30℃左右加入PH9的NaHCO₃缓冲液，最后用食用酒精沉淀DNA，使DNA成纤维状沉淀，经过滤，干燥，得到白色或微黄色纤维状DNA工业产品。

以下结合上述技术方案详述本发明：

本发明采用柠檬酸钠（Sodium-Citrate）和氯化钠（Sodium Clrororide）的混合液（以下简称SSC），碳酸氢钠（NaHCO₃）和纯度为95%的食用工业酒精为反应试剂。所述SSC溶液中的柠檬酸钠为食用级，取150g溶于10000ml水中搅拌均匀，使之溶解，再加60g食盐（NaCl）加入柠檬酸钠溶液，搅拌使之溶解。取100g食用级碳酸氢钠（NaHCO₃）加入10000ml水中，使之溶解，即成PH9的NaHCO₃缓冲液。

本发明工艺流程具体为7个步骤。

1、将精巢中的夹杂物（如脂肪、血块、肝、鱼鳔、结缔组织等）去除干净，并用清水洗涤，沥干水分后，称重。

2、将称重的精巢倒入组织捣碎机加一倍重量的SSC溶液，捣碎使成匀浆。

3、将匀浆倒入离心试管中，在天平上平衡，再在3000转/1分钟的冷冻离心机中离心8-11分钟，倾去上清液，留下沉淀。

4、以上操作重复三次，目的在于除去水溶性和盐溶性杂质，留下沉淀。

5、将沉淀取出，加相当原料重量1/20的PH9碳酸氢钠溶液，加入混合胰酶0.08-0.1%，搅拌均匀，於37℃下保温5-10分钟，夏天室温即可，继续搅拌均匀，水解完毕后倒入95%的酒精使DNA沉淀。

6、反复用酒精沉淀脱水三次后滤干酒精，即得成品。

7、将白色或微黄色纤维状成品置60℃左右的鼓风干燥箱中干燥。

与已有技术比较，本发明优点体现在以下几个方面：

1、生产工艺简单，从投料到出成品只需2-2.5小时，耗料少，收率大，平均提取率在10%以上，而已往技术要花2-3天，提取率仅4-5%。

2、无环境污染，生产条件温和，所用试剂均为食用级，对人体无副毒作用，而以往用的去蛋白剂是十二烷基磺酸钠或有机溶剂，耗费大且污染环境，生产出的产品不能用于食品添加剂。

3、取材容易，来源广泛，除从海水鱼精巢提取，还可从淡水鱼精巢提取。