[发明专利]新生隐球菌的鉴定方法及其所用的培养基

说明书

本发明涉及一种新生隐球菌的鉴定方法，即一种能够同时检测出该菌种尿素酶特性与酚氧化酶特性的鉴定方法以及该方法所使用的培养基。

新生隐球菌是临床引起隐球菌病的最主要病原性真菌，该病易发生于免疫功能受损的病人，尤其多见于AIDS患者。由于新生隐球菌感染的治疗困难，早期诊断及发现病原菌具有重要意义。传统上，国内外许多医学临床实验室都将尿素酶检测作为新生隐球菌鉴定的重要项目，其阴性结果往往是否定被鉴定菌株为新生隐球菌的主要依据之一。但是近些年，对新生隐球菌的研究结果表明，该菌具有明显的生物学多态性，尤其是新近发现该菌的尿素酶阴性株，这就给临床的菌种鉴定提出了鉴定方法的问题。传统方法显然不能鉴定出尿素酶阴性菌株。同时尿素酶试验方法已经应用了多年，其培养基的制备较为复杂。在我们研究过程中及结合国外已有的报告观察到具不同生物学特性的新生隐球菌均特异性地含有酚氧化酶活性，但是由于酚氧化酶检测的培养基的制备亦无一统一的简便方法，从而限制了这些检测项目的广泛使用。

另外，如果采用检测酚氧化酶的方法鉴定新生隐球菌，则在临床上仍需用传统方法再鉴别其尿素酶活性，以区分出尿素酶阳性菌株与阴性菌株。在两种不同培养基中分别进行两次试验，显然不利于结果的判断，而且费时，费力，经济上造成浪费。在同时作大量样品鉴定时，还增加了出差错的可能。

为了克服现有技术的上述缺陷，本发明将提供一种新生隐球菌的鉴定方法及其培养基，它能准确，简便，快捷，经济地鉴定出新生隐球菌，并且同时鉴定它的两种生物特性，即在检测酚氧化酶，以鉴定新生隐球菌的同时，鉴别出尿素酶阳性菌株或阴性菌株，将使该菌种鉴定的工作量减少到传统方法的1/3，有利于在临床上的推广、应用。

为完成上述任务，本发明提供下述技术方案：在同一培养基中同时设置两组针对不同生物特性的检测底物，即可因尿素酶的存在而使培养基变色的尿素酶检测底物，与可因酚氧化酶的存在而使菌落变色的酚氧化酶检测底物，同时在培养基中设置H⁺浓度调节剂，并控制两组底物的浓度与温度，以使两组检测反应同步进行，同时显示结果。

尿素酶是一种胞外酶，该酶作用于尿素，使其分解为NH₃和CO₂，导致PH升高使PH指示剂变色，如酚红由黄变红。酚氧化酶是一种胞内酶，该酶作用于双酚或单酚化合物如：多巴、甲基多巴、儿茶酚、咖啡酸等产生黑色素(melanin)，导致菌的生长菌落变为棕色。即同一培养基中含有二种相应的底物时，可以发生二个可以明确区分的酶反应，即尿素酶使培养基变色，酚氧化酶使菌落变色，从而达到同时检测二种酶活性的目的。

本发明实验方法如下：

①使用多因素正交试验及线性分析方法研究底物浓度、温度、H⁺离子含量等变化对二种酶同时反应的影响。

②对尿素酶反应选择更好的PH指示剂和最适量的尿素用量。

③比较并简化基础培养基并确定各种成分的用量(配方)，同时考虑在国内实施生产的可行性。

④与分别进行两种酶检测法比较在同一培养基上进行两种酶检测方法的可靠性。

⑤用多种临床常见的酵母或酵母样真菌作敏感生、特异性、检测效率及可行性分析。

经实验得到的综合试验培养基的配方为：尿素检测底物为尿素与适量的PH指示剂(如溴麝香草酚蓝或酚红等)；酚氧化酶的检测底物为单酚或双酚化合物，例如：咖啡酸、儿茶酚、多巴、多巴胺、没食子酸、肾上腺素、去甲肾上腺素或甲基多巴等；H⁺浓度调节剂为KH₂PO₄或NaH₂PO₄；培养温度在25℃；培养时间为24-72小时。培养基的赋型剂可以用玉米琼脂如Cornmeal agar(COifco，USA)或加入萄萄糖、蛋白胨与NaCl的琼指。其中玉米琼指还可用玉米浸出液代替，玉米浸出液的制作方法是取玉米粉40g，加入1000ml蒸馏水混匀，于90℃浸出15分钟(摇动)之后用尼龙布过滤，即可。实施生产的流程为：各种成份的称量→消毒灭菌→制成试管斜面→备用。使用方法为；接种待检菌后于25℃培养观察，72小时内可得到结果(见附图1和表1)。

即各组分的含量如下：

双酚或单酚化合物     0.3-0.6g/L

尿素                 3-20g/L

PH指示剂          适量(使用酚红时为0.005-0.02g/L，使用麝香草酚蓝时为0.0008-0.0002g/L)

H⁺浓度调节剂      0.1-0.8g/L