[发明专利]造血干细胞、祖细胞以及巨核细胞的扩增方法

说明书

本发明涉及一种新的扩增造血干、祖细胞，主要是巨核细胞及其祖细胞的方法，联合相继应用血小板第四因子(Plateletfactor 4，简称PF4)、造血细胞生长因子以及能调节血细胞生长因子活性的藻类多糖物质。

已知造血多能干细胞在一定的条件下，如在不同的造血细胞生长因子的刺激下能向粒单细胞、红细胞或巨核细胞祖细胞分化，进一步增殖产生成熟的白细胞、红细胞或巨核细胞。每个巨核细胞又能产生数千个有功能的血小板。

造血干细胞分化增殖产生成熟的血细胞这一复杂的细胞和生物学过程称造血发生(Hematopoiesis)。而造血干细胞分化成为巨核细胞祖细胞，再增殖产生巨核细胞，后者进一步成熟产生血小板，这一细胞和生物学过程称巨核细胞生成(Megakaryocytopoiesis)(韩忠朝等，中华血液学杂志，14：159-161，1993)。

已知不少因子如白介素(Interleukin或IL)3，6，11，粒单细胞集落形成刺激因子(GM-CSF)，干细胞因子(SCF)和红细胞生成素(EPO)能对巨核细胞生成这一过程起调节作用，但一些在体外有一定刺激作用的因子在体内却没有作用或作用甚微(Han等，Int J Hematol，54：3-14，1991)。已知再生障碍性贫血(再障)病人或动物血清中含有多种造血细胞生长因子如SCF、EPO、GM-CSF、IL6、粒细胞集落形成刺激因子(G-CSF)和成纤维细胞生长因子(FGF)，对造血干细胞和祖细胞有明显的刺激作用。此外还含有对巨核细胞和血小板的生长有特异性刺激作用的因子。目前已经纯化分离和分子克隆出二种因子，一种是c-Mpl ligandthrombopoietin／MK-CSF(血小板生成素／巨核细胞集落形成刺激因子)，对巨核细胞和血小板生成有明显刺激作用(Sauvage etal，Nature 369：533-538，1994； Kaushansky et al，Nature369：568-571，1994)，另一种是发明者从再障病人的尿中纯化分离出一种新的造血细胞生长因子-巨核细胞生成素(MPO)，它对巨核细胞的生长和血小板生成也有明显刺激作用。

在正常情况下，造血干细胞和祖细胞主要存在于骨髓中，新生儿脐带血中含量也很丰富，成人末梢血则含量甚微。骨髓和脐带血都可用作造血干祖细胞的来源。但是每个脐带所含的血中和每次可采集的骨髓中含有的造血干祖细胞的绝对数较低，不能满足移植的需要。根据一些资料统计，每个脐带所含的血量平均为100ml，可分离40×10⁷单个核细胞，约2-5×10⁴粒单细胞集落形成单位(CFU-GM)。如模拟体内条件(EX VIVO)进行体外扩增可以使造血干祖细胞的数量增加几倍到几十倍。这些细胞可以供移植需要，也可长期冻存，建立造血干细胞库。这些细胞输人体内，可很快分化增殖形成成熟血细胞，因此可以治疗各种血细胞减少症，也可移植给骨髓衰竭病人，重建其造血功能。

目前进行造血干祖细胞EX VIVO扩增的方法主要为分离采集脐带血或骨髓单个核细胞或CD34⁺细胞，然后体外培养，加入一种或多种血细胞生长因子去刺激干细胞向祖细胞分化，使祖细胞的数量在一定时间内明显增多。最常用的因子有IL1、IL3、IL6、SCF、GM-CSF、G-CSF和EPO。这些方法能扩增CFU-GM和暴式红细胞集落形成单位(BFU-E)，对干细胞也有作用，但对巨核细胞祖细胞的作用有限。最近的资料进一步表明脐带血单个核细胞移植后的血小板恢复较慢。因此新的祖细胞扩增和采集方法为脐带血或骨髓的移植所必需。

为此，本发明目的是提供一种体外扩增和大量制备人和动物造血干细胞、祖细胞以及巨核细胞的方法，是在培养条件中加入人血小板第四因子和(或)藻类多糖，或与造血细胞生长因子联合相继或同时使用。