[发明专利]高活性植物抗冻蛋白及其分离技术

权利要求书

1.一种高活性植物抗冻蛋白，其特征在于是从抗寒植物中分离出来的一种高活性抗冻蛋白，含该高活性抗冻蛋白的抗寒植物经匀浆、硫酸铵沉淀、DE—52离子交换柱和SephadexG100分离的产品，在30mg/ml浓度下，融点约为-10℃--14℃，再经灌注层析分离纯化、20mg/ml浓度下，融点约为-15℃--20℃，在相差镜下可观察到呈多边形立体结构冰晶，用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳并银染后，测定分子量范围为94—13KDa，其中包括41、38、34、24、15和13KDa等，尤其34和/或15KDa抗冻活性更高。

2.一种高活性植物抗冻蛋白的分离技术，其特征在于其分离技术具体步骤如下：

(1)将抗冻植物和溶液(1)按一定重量体积比混合、搅拌并高速匀浆，使其成均匀浆液：

将新鲜的或冷冻(-20℃--80℃)的抗寒植物置入溶液(1)中、混合、高速匀浆成匀浆液，溶液(1)具体成份及配比为：

1.5—3.0mMTris—HCl，0.1MkCl，pH值为7—8，溶液(1)中还含有0.1mMEDTA，5mM巯基乙醇，1mMPMSF。

(2)将上述匀浆液经挤压、去渣、获得其清液，

(3)将上述清液经20000g离心15分钟，弃去沉淀，

(4)加硫酸铵至30％或90％或30—60％或60—90％饱和度，再经20000g离心15分钟收集沉淀物，

(5)在收集的沉淀物中加溶液(2)，溶解沉淀物，经超滤器超滤脱盐，

溶液(2)成分及配比为：5mMTris—HCl，pH值为7-8，0.1MKCl，溶液(2)中还含0.1mMEDTA，5mM巯基乙醇。

(6)上DE—52离子交换柱，将非蛋白杂质除去，获得较纯净的蛋白质。

经脱盐后的样品，用溶液(2)适当稀释，上到经常规酸碱处理并经溶液(2)平衡的DE—52柱，上柱后，再用适量溶液(2)洗去非特异性吸附的杂质，达到流出液经紫外检测已无明显蛋白质洗出，即平衡，

(7)用梯度仪以溶液(2)—溶液(3)梯度洗脱，洗脱液经超滤，浓缩。溶液(2)成份及配比同步骤(5)中溶液(2)，

溶液(3)成份及配比：0.5MKCl，25mMTris-HCl，pH值为7-8，溶液(3)中还含0.1mMEDTA，5mM巯基乙醇，

(8)将已经浓缩的样品用溶液(4)过分子筛SephadexG100柱，

溶液(4)成份及配比：25mMTris-HCl、pH值为7-8，0.1MKCl，还含0.1mMEDTA，5mM巯基乙醇，

(9)分离样品、经超滤脱盐、浓缩、冷冻干燥即制得本发明提供的高活性植物抗冻蛋白；

3.按权利要求2所述的高活性植物抗冻蛋白分离技术，其特征在于用灌注层析分离技术，可制得进一步纯化的高活性植物抗冻蛋白。