[发明专利]高效抗肿瘤γ型干扰素突变体的制法和用途

说明书

本发明涉及一类人工设计构建的新型、高效的抗肿瘤药物——人γ型干扰素—表皮生长因子受体结合域融合蛋白的制作技术及其用途。这类突变体与母体分子比较，具有活性高、特异性强的优点。

干扰素是一类重要的细胞素，它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、抗细胞分裂、免疫调节等多种生物学活性。经10多年临床应用研究表明，它是一种重要的抗病毒、抗肿瘤治疗药物。迄今所知，人、小鼠、牛、马等哺乳动物的干扰素均有α、β、γ等三个型别。其中γ型干扰素具有较强的免疫调节活性，所以又称免疫干扰素。但是，临床治疗肿瘤的疗效却不如α型干扰素明显。

成熟的人γ型干扰素由143个氨基酸组成；含有较丰富的碱性氨基酸残基，其C末端有一多价阳离子区RKRKRS，C末端易受蛋白酶的降解而使C端不均一。人γ型干扰素的C端可缺失11个氨基酸，而其抗病毒活性不受影响。γ干扰素的活性型为二聚体。

许多肿瘤细胞表面富有表皮生长因子受体(EGFR)，它的配体除表皮生长因子(EGF)外，还包括α转化生长因子(TGF-α)，痘苗病毒生长因子(VGF)，Shope纤维瘤病毒生长因子(SVGF)，粘液瘤病毒生长因子(MVGF)。属于EGF超家族的成员还有：肝素结合生长因子(HB-EGF)，基膜素(Laminin)，双性调节素(Amphiregulin)，低密度脂蛋白(LDL)的结构域同源区，神经分化因子(NDF)凝血丝氨酸前体蛋白C(蛋白C)等。上述多肽具有相类似的结构：与EGF受体有高度亲和性，在EGF敏感细胞中引起丝裂效应。在其一级结构中有高度保守的6个Cys，第36和39位的Gly也是高度保守的。分子内部形成3个二硫键环。实验证明，TGF-α的第三环能与EGF竞争受体，并且阻断EGF对细胞增生的诱导，说明TGF-α的第三环具有与受体结合的功能，但无有丝分裂原活性(Nestor et al 1985 Biochem.Biophys.Res.Commun.129：226)；同样，采用痘苗病毒19KD蛋白中与EGFC环的一段同源序列，也获得同样结果。Eppstein等(Nature 318：663，1985)也合成了TGF-α和痘苗病毒VVGF的C环，发现它们有与EGF结合的功能；Purchio等(Gene60：175，1987)将TGF-α的C环置换为VVGF的C环，结果TGF-α的活性不变；Heath等(PNAS 83：6367，1986)的部分实验也支持Nestor的结论，即EGF的C环具有与EGFR结合功能，但无有丝分裂原效应。但也有部分实验认为EGF的B环才是与EGFR结合的主要区段，C环只起辅助作用。(Komoriyaet等PNAS 81：1351，1984)。

本发明是在人γ型干扰素的C末端去除对其活性发挥非必需的11个氨基酸，与证明无致癌作用的痘苗病毒生长因子(HindIII C片段19KD蛋白)第三环的15个氨基酸连接，连接肽为Pro Gly Ile三肽。这一融合蛋白已证明具有较强的抗肿瘤细胞分裂活性。

采用类似的方法构建成小鼠γ型干扰素—小鼠EGF C环融合蛋白，在细胞水平和小鼠机体水平验证了这一抗肿瘤多肽的可靠性。

C端缺失11个氨基酸的人γ干扰素(IFN-γPGIL)突变体

IFN-γPGIL突变体的构建：

pγ为带有全长人γ型干扰素cDNA的表达质粒，载体为带有PRPL启动子和λcits857基因的pBV220。以EcoRI消化pBV220/IFN-γ，获得全长IFN-γcDNA，再以BglI和HinlI消化，获得0.43kd片段，后者含有HuIFN-γcDNA N′端132个氨基酸，再与编码Pro Gly Ile Leu的寡核苷酸序列连接，接TAG翻译终止密码子，后者含多酶切点。

人γ型干扰素母体cDNA的3′端序列及部分氨基酸序列：

397nt

AGT CAG ATG CTG TTT CGA GGT CGA AGA GCA TCC CAG TAA

132aa

Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala Ser Gln  *

人γ型干扰素-PGIL(HuIFN-γ PGIL)突变体的部分核苷酸和氨基酸序列：

397nt

AGT CCG GGG ATS CTC TAG

132aa

Ser Pro Gly Ile Leu  *

以上序列由酶切分析和DNA测序所证明。

HuIFN-γPGIL突变体的生物学活性