[发明专利]稻瘟病抗性基因的核酸标记物以及通过使用这些标记物分离到的稻瘟病抗性基因

说明书

本发明涉及用于分离稻瘟病抗性基因的核酸标记物以及通过使用这些核酸标记物分离到的稻瘟病抗性基因。

可以用本发明的核酸标记物进行标记的稻瘟病抗性基因不仅对于制备优势栽培稻种是非常有用的，而且可作为研究用材料以及用于制备能被导入到各种植株中的新的抗性基因的遗传资源。

本领域内技术人员熟知存在着能给植株提供抗病原体抗性的基因，并且在常规育种尝试中导入这些基因已经是重要的指标。因此至今通过导入这些抗性基因已制造了许多新类型的栽培种。鉴于这种生物方法通过利用植株的遗传功能而阻碍瘟疫流传将降低化学杀虫剂的消耗，并且促进了人类健康以及保存了完好的环境，还能降低农业成本，因此这些抗性基因的重要性将在世界范围内日益提高。

在抗病原体的植物抗性基因中。首先在日本发现了稻瘟病抗性基因，并且从此以后已发现了许多这样的基因的存在。尤其是，来自于印度稻的抗性基因对在日本发现的许多种稻瘟病真菌显示有抗性，并且是十分有用的遗传资源。在其它基因中，来源于印度稻的Pi-b，Pi-ta和Pi-ta²基因适用于分析基因的RFLP图谱。但是仍然仅有十分有限的情况将基因导入现存的优良的栽培种。

大概的原因是常规的育种方法需要通过许多代回交将抗性基因导入一个栽培种，并且伴随该过程，每年将病原体接种到许多单株上进行抗性试验。由于严格控制外源病原体输入，在日本国内对外来病原体进行抗性检测几乎是不可能的。

另一方面，在植物生物技术方面的最新进展已能认别和分离各种基因，然后将它们导入到其他植株中。因此，对于植物抗性基因，使用遗传工程技术将它们克隆后导入到任何有用的栽培种中并不困难，这样将大大地降低在繁育抗性栽培种时需要的时间及劳动力。还可以阐明抗性基因怎样在植株中活动，并且怎样可以修饰该基因以及然后怎样提供新的抗性基因类型的机理。现在许多研究组正在努力研究以分离到抗性基因，但至今仅有几个组获得了成功。这可归因于下列事实：只知道有限的关于抗性基因产物的生化特征的信息。

作为一种分离基因的方法，一种已知的定位克隆的抗术现在正引起人们的注意。该技术利用基因图谱中靠近靶基因的核酸标记物，并且从基因组文库中分离出靶基因。实际上，使用该技术已经分离到了某些引起人类遗传病的基因。

虽然在植物中已报道的这种定位克隆仅有几种成功的情况，但根据下列原因据认为稻是该技术最合适的植物：(1)在主要的作物中稻有最小的基因组尺寸；(2)水稻中与一个单位遗传距离(CM)相对应的物理距离(以kb计)非常小；(3)通过使用几个邻近的等基因系(NIL)很容易限制基因位点范围，其中已通过将印度稻衍生的基因渐渗到日本稻本底而产生邻近等基因系(NIL)；以及(4)将基因导入到互补测试的细胞中很容易。

这种定位克隆过程成功的一个重要关键点是否能得到一个相邻接的有效标记物。根据稻基因组大小和遗传图谱的计算结果，估计对应于稻遗传图谱的1厘摩(cM)的物理距离基于核酸来计算大约为100-200kb。另一方面，插入的酵母人工染色体(YAC)的平均大小大于200kb。因此，如果有一种距离小于100kb，即0.5-1.0cM的抗性基因的DNA标记物，该基因的定位克隆成功的可能性被认为是非常高的。

使用这样的稻瘟病抗性基因的邻近核酸标记物还可以大大地降低在常规育种中例如通过回交而检测抗性所需的时间和劳动力。

本发明目的提供适用于稻瘟病抗性基因的新的邻近核酸标记物，以及使用这些标记物分离并克隆的这些稻瘟病抗性基因。

本发明提供了稻瘟病抗性基因的核酸标记物，这些基因是从稻基因组DNA中分离的；标记物DNA序列总长度高至2kb，并且在两个末端带有至少10个碱基的两个相同序列；并且定位于距水稻瘟病抗性基因Pi-b，Pi-ta或Pi-ta²，2.0厘摩(cM)的距离内。

本发明还提供了定位于上面介绍的核酸标记物附近的二级核酸标记物，以及利用这些标记物分离到的稻瘟病抗性基因和与这些基因相关的基因组。

根据本发明，提供了适用于分离稻瘟病抗性基因Pi-b，Pi-ta²或Pi-ta的有效标记物。通过这些核酸标记物的应用，便可以方便地从各种栽培稻种中分离到稻瘟病抗性基因以及相关的基因组，从而有利于开发和繁育出优良栽培种。还可以方便地完成水稻抗性检测。开创了制备新的抗性基因的途径。

图1.表示将稻瘟病抗性基因Pi-b导入日本栽培种的谱系图。底下划线表示带有抗性基因的栽培种。