[发明专利]含IL-II和毒素基因片段的分子导向药物的基因克隆及表达

说明书

本发明涉及一种含白介素II和免疫毒素基因片段的分子导向药物的基因克隆及表达，具体地将涉及含白介素II和绿脓毒素基因片段的分子导向药物的基因克隆及表达，及其在克隆和表达过程中使用的载体，工程菌和表达产物。

导向治疗目前已成为现代治疗学中十分看好的一只独秀，具有很强的生命力，所述的导向治疗即利用特异地结合细胞表面受体的配基作为载体将毒性基团(TOXICMOIETY)等弹头引导至体内非正常组织，将其杀死从而达到治疗作用。早在本世纪初，德国的Paul Eeh根据抗原抗体结合原理，提出了针对肿瘤细胞的″魔弹″的概念(Himmelwell，F.1960.The collected Papersof Paul Ehrich Vol，3 Pergamon)，此后，全世界众多的科学家在此基础上进行了大量有益的研究探讨，使导向药物的研究有了巨大的发展。作为导向药物的弹头经历了重金属、同位素、抗生素、细胞因子及酶抑制剂等过程进年来广泛采用的是毒性极强的细菌性或植物来源的蛋白毒素，如绿脓毒素、白喉毒素、相思豆毒素、蓖麻毒素和蒴莲根毒素等。这种以蛋白毒素作为弹头的导向药物又称为免疫毒素，它成为当前导向药物的主流。

免疫毒素的发展经历了三个阶段，第一阶段的免疫毒素是由包含A、B肽链的完整毒素和抗体的交联物，本领域技术人员熟知，白喉毒素、相思豆毒素、蓖麻毒素和蒴莲根毒素等均由A、B两条链组成，单独的一条肽链对细胞或整个动物都没有毒性。B链负责结合到大部分细胞膜的受体上，A链穿透细胞膜完成抑蛋白合成的致死作用，参见Moolten，F.L.and Cooperband，S.R.(1990).Science 169，68-70；Mool ten，F.L.，Capparell，N，J.，Zajdel，S.H.and Cooperband，S.R.(1975).J.Nat.Cancer Inst.55，473-477。为了产生强列而有选择性的细胞毒作用，人们将毒素的A链连接到与细胞结合的实体，如抗体分子上，完全去除毒素的B链，利用完整毒素所遇到的非特异性结合的问题就可以解决，这样的结合物对动物无毒性，此乃第二代免疫毒素。参见Masuho，Y.，Hara，T.andTeruhisa，N.(1979).Biochem.Biophys.Res.Commun.91，143-151；Masuho Y.and Hara，T.(1980).Gann 71，759-765；Miyazaki，H.，Beppu，M.，Terao，T.and Osawa，T(1980).Gann 71，766-774.。

近年来，随着现代分子生物学特别是基因工程和蛋白工程的发展，已对很多作为载体的配体及作为弹头的毒素的分子结构和基因结构有了深入的了解，使设计免疫毒素不必再采用分子量很大的整个毒素分子和整个抗体分子，而是选用配基中与受体结合的功能区(DOMAIN)的基因和毒素中跨膜和毒性基团的基因，按导向治疗的目的要求，在基因水平上组合出新的重组免疫毒素基因，并可按照人为修饰改造不同的基团，使其功能按照人们的要求发生一定程度的改变，这种重组的基因片段表达后即可产生第三代的免疫毒素，即基因工程重组免疫毒素，也称分子导向药物。这种毒素的载体通常采用蛋白抗体的最小结合片段、细胞生长因子、激素和CD4等，而弹头则通常采用细菌毒素，如去掉结合部位的绿脓毒素PE40及白喉毒素DT388。由于第一、第二代毒素是应用某些异型双功能交联剂使毒素和抗体通过二硫键或硫醚键交联，这种化学制备方法比较复杂，得率低，欠安全，而且在体内不稳定，加速了免疫毒素的降解，毒素部分含有的糖残基使得这类免疫毒素在体内很快被清除，毒素和抗体的结合物由于分子量大，因此渗透性差，并且容易引起机体对这类免疫毒素的免疫中和反应，而基因工程重组毒素中毒性基团与导向载体的偶联是基因之间的融合，且对弹头和载体的修饰可使免疫毒素分子量达到最小，这样就增强了免疫毒素的特异性、稳定性、渗透性，降低了免疫原性，另外应用基因工程的方法，易于大规模生产，高产率，高纯度以及成本低廉，如见Siegall CB et al.，FASER J，1989；3：2647；Chaudhary VK et al.，Pro.Natl.Acad.Sci.USA，1990；87：1066； Batra JKet al.，Bio Chem.1990；265：15198等等。