[发明专利]用于内毒素特异性鉴别的试剂

说明书

本发明涉及使用了鲎变形细胞溶解物试剂的用于内毒素特异性鉴别的试剂、鉴别内毒素的方法、用于该鉴别方法的试剂盒、G因子激活作用抑制剂组合物。

业已知道使用鲎变形细胞溶解物(下文中有时简称为溶解物)鉴别内毒素(下文中有时简称为Et)的方法。这一鉴别方法一般称作“鲎试验”，参与这一鉴别的溶解物的反应称作“鲎反应”。由于检测灵敏度高，这一方法已经常用于各领域包括药物或水的热原检测和临床诊断中。该方法基于有痕量Et存在下溶解物的凝固。最近的生命化学研究证明这一反应包括了几个凝固因子的逐步激活[J.Protein Chem.，5，255-268(1986)]。

使用从Tachypleus tridentatus获得的溶解物的反应可结合附图1来说明。当Et加入到溶解物中时，存在在溶解物中的C因子(一种Et敏感因子，分子量为123,000)被激活。然后，如此形成的激活的C因子限制性水解B因子(分子量为64,000)的特异位点从而形成激活的B因子。激活的B因子激活前凝固酶(proclotting enzyme)(分子量为54,000)使其转化为凝固酶。该凝固酶在以二硫化物键交联的环的特异位点(即，Arg¹⁸-Thr¹⁹和Arg⁴⁶-Gly⁴⁷)限制性水解凝集原(促凝剂蛋白，分子量为19,723)。这样，由H-Thr¹⁹...Arg⁴⁶-OH(含有28个氨基酸残基)所代表的C肽游离出来，残余部分转化成凝固素胶。这样，鲎反应由一系列反应组成，该反应也称作串联(cascade)反应(这一由Et引发的串联反应此后称作C因子系统反应)。

另一方面，业已阐明，该溶解物质反应不仅针对Et，也针对样品中的(1→3)-β-D-葡聚糖(此后有时简称作β-葡聚糖)。就是说，示于附图1的G因子(一种β-葡聚糖敏感因子)被激活，由此形成的激活的G因子激活前凝固酶成凝固酶，从而形成凝固素胶。(这一由β-葡聚糖引发的串联反应此后称作G因子系统反应)。

上述串联反应中形成的凝固酶将分别加到该反应系统里以释放对硝基苯胺的合成底物中的酰胺键进行水解。所述合成底物例如，t-丁氧羰基-亮氨酰-甘氨酰-精氨酸-对硝基酰苯胺(Boc-Leu-Gly-Arg-pNA)，Boe-Val-Leu-Gly-Arg-pNA(SEQ ID NO：1)、苄氧羰基-亮氨酰-甘氨酰-精氨酸-对硝基酰苯胺(Z-Leu-Gly-Arg-pNA)Boc-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA(SEQ ID NO：2)，Boc-Val-Ser-Gly-Arg-pNA(SEQ ID NO：3)或Boc-Ser-Gly-Arg-pNA。因而，Et或β-葡聚糖可通过测定有色物质(对硝基苯胺)的吸光度来定量。

如上的讨论，溶解物通常含有既参与C因子系统反应，又参与G因子系统反应的组分。当使用这一溶解物鉴别该样品中的Et时，恐怕会进行由可能包含在该样品中的β-葡聚糖引发的G因子系统反应并产生错误的结果。

由此，业已证明，鲎试验是一种不是对Et特异的鉴别方法，因而，人们一直尝试着建立用于Et特异性鉴别的方法。

例如，已知当具有一定数量的键合在其中的(1→3)-β-D-葡糖苷结构单元的聚葡糖苷(polyglycoside)加入到溶解物，或将能固定聚葡糖苷的不溶载体或不溶于水的聚葡糖苷与该溶解物接触时，因子G的激活作用被抑制，而因子c系统反应不受抑制，由此可特异性鉴别内毒素(US专利5,155,032、5,179,006和5,047,353；JP-A-2-216462、JP-A-221863和WO92/06381，其中使用的“JP-A”一词意指“未经审查出版的日本专利申请”)。

然而，这些方法需要复杂的操作步骤，包括部分分解和/或碎化(1→3)-β-D-葡聚糖，收集抑制G因子激活作用的组分，并进一步除去内毒素。