[发明专利]新的细胞表面蛋白质

说明书

本发明涉及以发酵工艺繁殖用于生产有用物质如L-氨基酸的微生物，以及使用上述微生物以发酵工艺生产有用物质如L-氨基酸的方法。具体地说，本发明涉及衍生于乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)的新的细胞表面层蛋白质，含有编码该蛋白质之基因的DNA片段及其应用。

棒状细菌[或称棒状杆菌或棒杆菌(Coryneform bacteria)]是大量产生L-氨基酸如L-谷氨酸或L-赖氨酸的微生物，已为改善L-氨基酸之生产能力的目的对其进行了繁殖。已进行了各种研究工作，并且迄今已报导了使用基因操作技术繁殖氨基酸生产菌的实例(Biotechnology letters，2(1980)525-530，Appln.Environ.Microbiol.144(1979)181-190，Abstruct of Lecture for theMeeting of the Society of Agricultural Chemistry of Japan(1981) 8)。然而，所有这些工作都是针对着利用氨基酸微生物合成系统中的基因作为材料并通过提高基因表达来改善每个细胞之目的氨基酸的生产量，而不是针对在分析细胞表面结构的功能的基础上改善氨基酸生产能力。

顺便提到的是，用发酵工艺生产氨基酸时，通常要在纯化所生产的氨基酸的过程中进行离子交换层析，但是如果细菌细胞留在发酵培养基中，当发酵培养基通过离子交换树脂柱时就会阻塞树脂柱，因此必须有一个从发酵培养基中除去细菌细胞的步骤。此步骤通常是通过离心、过滤等方法进行的，如果能够安全而又简化地进行细胞分离则在工业上将是常有用的。

已经知道，由于在培养后依据微生物的类型而出现细胞聚集等现象，致使微生物细胞在培养基中沉淀出来，并极其容易地从培养基中分离这些微生物细胞。然而，尚未报导过具有这种性质的用于氨基酸生产的棒状细菌，并且也还不知道提供有聚集或沉降性质之微生物细胞的方法。

WO 93/03158号的已公开文本中描述了一种与本发明的K蛋白质相似的新的细胞表面层蛋白质，但这种蛋白质显然不同于K蛋白质。此外，该说明书公开了一种利用细胞表面层蛋白质之信号肽的蛋白质表达-分泌系统，但尚不知道此蛋白质有助于掺入棒状细菌营养素以及细菌细胞的聚集性质。

再者，虽然棒状细菌已作为L-氨基酸生产菌在工业上使用，但最近才发现它们是有高度分泌性的，并且已在利用杆菌的实践中尝试将其用于生产不同的蛋白质。上述国际公开WO 93/03158号文本中也说明了这种技术。

本发明将解决的主题是得到有助于掺入棒状细菌营养素的新的细胞表面层蛋白质及其基因，并得到经在棒状细菌细胞中扩增此基因而获得的转化体。本发明还有一个目的是使用具有产生有用物质如L-氨基酸之活性的棒状细菌作为转化体的宿主，并改善使用上述宿主细菌经发酵工艺生产有用物质如L-氨基酸的方法，以及得到缺失该新的细胞表面层蛋白质和具有聚集性质的棒状细菌，以便简化氨基酸生产工艺。

作为一个重要的研究成果，本发明人已成功地获得了一种有助于掺入细菌营养素的新的细胞表面层蛋白质和其基因，并已完成了本发明。

具体地说，本发明提供了衍生于乳糖发酵短杆菌、分子中具有以下两序列且分子量约为63,000道尔顿的新的细胞表面层蛋白质：(1)Thr-Leu-Arg-Gln-His-Tyr-Ser-Ser-Leu-Ile-Pro-Asn-Leu-Phe-Ile-Ala-Ala-Val-Gly-Asn-Ile-Asn-Glu-Leu-Asn-Asn-Ala-Asp-Gln-Ala-Ala-Arg-Glu-Leu-Phe-Leu-Asp-Trp-Asp-Thr，和(2)Asn-Lys-Thr-Asp-Phe-Ala-Glu-Ile-Glu-Leu-Tyr-Asp-Val-Leu-Tyr-Thr-Asp-Ala-Asp-Ile-Ser-Gly-Asp-Ala-Pro-Leu-Leu-Ala-Pro-Ala-Tyr-Lys，含有编码该蛋白质之基因的DNA片段，将该DNA片段与能够在棒状细菌细胞中自动复制之载体连接而得到的重组DNA，在棒状细菌的细胞中引入并扩增该DNA片段而得到的转化体以及以发酵工艺生产有用物质如L-氨基酸的方法，该方法包括在培养基中培养具有产生有用物质如L-氨基酸之活性的转化体，在培养基中生成并积聚有用物质，并从培养基中收集该有用物质。

本发明提供了具有细胞聚集性质并缺失上述细胞表面层蛋白质或与上述存在于棒状细菌细胞表面上的蛋白质基本相同之蛋白质的棒状细菌。