[发明专利]折回三螺旋形成寡核苷酸

说明书

本发明涉及合成寡核苷酸。更详细地说，本发明涉及用于调节基因表达的合成寡核苷酸。

自从Zamecnik和Stephenson(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75：280-284(1978))首次证实合成寡核苷酸对病毒复制的抑制以来，人们对作为治疗剂的寡核苷酸已引起极大兴趣。近些年来，对作为治疗剂和基因表达调节剂的寡核苷酸的开发活动也越来越激烈了。最大的进展是在可与目标mRNA形成Watson-Crick双螺旋的所谓反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide)的使用上。Agrawal(Trends in Biotechnology，10：152-158(1992))详细综述了反义寡核苷酸作为抗病毒药剂的进展情况。

一个同样重要，但还没有充分开发的方法是所谓的反基因寡核苷酸方法(antigene oligonucleotide approach)，其中，寡核苷酸通过Hoogsteen碱基配对与目标DNA双螺旋形成三螺旋。Chang和Pettitt(Prog.Biophys.Molec.Biol.，58：225-257(1992))最近曾对后一方法进行了综述。曾观察到DNA和不同类型的寡核苷酸之间形成的三螺旋结构。Cooney等(Science，241：456-459(1988))讲述了DNA和寡脱氧核苷酸磷酸二酯之间三螺旋的形成。Latimer等(Nucleic Acids Res.，22：1549-1561(1989))公开了寡脱氧核苷酸硫代磷酸酯参与的三螺旋的形成。Kibler-Herzog等(NucleicAcids Res.，18：3545-3555(1990))公开了短的寡脱氧核苷酸甲基膦酸酯参与的三螺旋的形成。也已知了促进三螺旋形成的不同的碱基修饰，包括胞嘧啶核苷的C5-甲基化(Xodo等，J.Molec.Biol，19：5625-5631(1991))，使用二环胞嘧啶核苷类似物，MODA(Young等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：10023-10100(1991))，和使用合成α-异构核苷酸(Praseuth等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：1349-1353(1988))。Giovannangeli等(J.Am.Chem.Soc.113：7775-7777(1991))讲述了在加帽的寡核苷酸5′端加上吖啶插入物也增加三螺旋的稳定性。寡核苷酸中介的三螺旋的形成，至少在体外可造成转录的抑制(参阅Cooney等和Young等前述文献)。

反义寡核苷酸方法和反基因寡核苷酸方法二者都能调节基因表达，并以此为目标，这对理解基因的表达，和涉及基因表达的疾病或状况的治疗都是有益的。非常适于达到这些目标的寡核苷酸化合物的两个主要特点是高度的特异性和结合后对基因表达的干扰能力。增强这些特性总是人们所期望的。因而，需有一种具有更强的特异性和能形成更稳定的复合物的新的寡核苷酸，使其比现有化合物具有更强的干扰基因表达的能力。

本发明提供了比现有寡核苷酸具有更强特异性和能与目标核酸形成更稳定复合物的新的寡核苷酸。根据本发明的寡核苷酸具有一个双螺旋形成区，该区通过Watson-Crick碱基配对与一个单链目标核酸杂交，并有一个三螺旋形成区，该区折回到双螺旋形成区与目标核酸形成的双螺旋上，落入大沟，并在此通过Hoogsteen碱基酸对与目标核酸形成三螺旋。双螺旋形成区和三螺旋形成区是由连接区连接在一起的，该连接区可以是允许双螺旋形成区和三螺旋形成区都结合到目标核酸上的一个寡核苷酸环或任一种柔韧的化学结构。因而，根据本发明的目标核酸与寡核苷酸之间形成的复合物，在调节基因表达方面，既具有类似于反义方法中的双螺旋结构的特点，也具有类似于反基因方法中的三螺旋结构的特点。因为同一个寡核苷酸既具有双螺旋形成的功能也具有三螺旋形成的功能。该结构被称为折回三螺旋(foldback triplex)，而根据本发明的寡核苷酸，即与目标核酸结合而形成折回三螺旋的寡核苷酸被称为折回三螺旋形成寡核苷酸(foldback triplex-forming oligonucleo-tides)。