[发明专利]控制昆虫的方法

说明书

发明领域

本发明涉及通过提供可直接用于植物的蛋白质或由微生物在其上产生的蛋白质，或者通过用遗传工程方法修饰植物以产生所述蛋白质来控制植物昆虫感染的方法，本发明还涉及在所述方法中有用的微生物和植物。本发明背景

使用包括蛋白质在内的天然产物是熟知的控制许多昆虫害虫的方法。例如，用苏云金芽孢杆菌(B.t.)内毒素控制鳞翅目和鞘翅目昆虫害虫。生产这些内毒素的基因已被导入并已由各种植物，包括棉花、烟草、番茄表达。然而，还存在一些对B.t.内毒素不敏感的经济上重要的昆虫害虫。这些重要害虫的例子有棉象虫(BWV)、Anthonomus grandis和南瓜十二星叶甲(CRW)(条叶甲属)。另外，其他用于控制对B.t.内毒素敏感的昆虫的不同基因产物，如果不是致死的，则对于抗性处理也是重要的。

在植物中发现了其他几种已知的杀虫蛋白质，包括植物凝血素、淀粉酶抑制剂和蛋白酶抑制剂。在以高剂量使用时，它们会影响昆虫的生长和发育[Boulter et al.，1989；Broadway and Duffey，1986；Czapla and Lang，1990：Gatehouse et al.，1986；Heusing et al.，1991；Ishimoto and K.Kitamura，1989；Nurdock et al.，1990；Shukle and Murdock，1983]，但不会提供由B.t.蛋白质所给予的急性致死性。

本发明的一个目的是提供能控制BWV、CRW或其他昆虫害虫的蛋白质和生产所述蛋白质所用的基因。本发明的另一目的是提供遗传构建体和将所述遗传物质插入微生物和植物细胞的方法。本发明的另一目的是提供含所述遗传物质的转化微生物和植物。本发明概述

已经发现马铃薯贮存蛋白(patatin)(马铃薯块茎的主要贮存蛋白质)可以控制各种昆虫，包括玉米幼芽根叶蛼(WCRW)、Diabrotica virgifera、southern corn rootworm(SCRW)、Diabrotica undecimpunctata和棉象虫(BWV)、Anthonomusgrandis。马铃薯贮存蛋白对于一些幼虫是致死的，并会阻碍幸存者的生长以致防止或严重延缓了幼虫的成熟，从而使其无法繁殖。可以将这些已知具有酯酶(脂酰基水解酶)活性的蛋白质直接用于植物或用其他方式转导，例如通过使用已转化的生产所述酶的植物-定殖微生物，或者用相似转化后的植物本身。

马铃薯贮存蛋白是在马铃薯[Gaillaird，1971；Racusen1984；Andrews et al.，1988]和其他植物，尤其是茄形(solanaceous)植物[Ganal et al.，1991；Vancanneyt et al.，1989]中发现的蛋白质家族。在马铃薯中，马铃薯贮存蛋白主要是在块茎中发现的，在其他植物器官中的水平很低[Hofgen and Willmitzer，1990]。已检测了几种马铃薯贮存蛋白同工酶的酯酶底物特异性[Hofgen andWillmitzer，1990；Racusen，1986]。

以前已由Mignery等人(1984)、Mignery等人(1988)、Stiekema等人(1988)和其他人分离了编码马铃薯贮存蛋白的基因。Rosahl等人(1987)将其转移到烟草植物中，并观察了马铃薯贮存蛋白的表达。这表明可以由植物异源表达马铃薯贮存蛋白。

相似地，可以分离马铃薯贮存蛋白基因，然后将其插入适当的转化载体盒中，然后(1)用所述盒转化植物一定殖微生物，当用于植物时，所述微生物表达生产马铃薯贮存蛋白的基因，由此控制昆虫，或者(2)将所述盒掺入植物基因组中，然后通过表达基因并生产马铃薯贮存蛋白可保护其自身免受昆虫的攻击。另外，可以转化或培育植物以共表达一种或多种编码控制昆虫的蛋白质的B.t.基因。这就使植物要么(1)抵御较多种类的害虫和/或要么(2)对一些害虫有两种作用模式，这是抗性处理中的一种重要手段。转化后表达B.t.基因的植物实例公开在欧洲专利公开No.0，385，962中，相当于美国系列申请号476,661,1990，2，1 2申请[Fischhoff等人](该文献掺入本文作为参考)。另外，由于已经表明蛋白酶抑制剂提高其他杀虫蛋白的活性，所以可以转化或者培育植物以便共表达蛋白酶抑制剂基因，如编码马铃薯木瓜蛋白酶抑制剂[Rodis and Hoff，1984]或大豆胰蛋白酶抑制剂[参见Ryan的有关综述，1990]的那些基因。