[发明专利]纤维素结合区域

说明书

本申请是1993年4月14日提交的美国专利申请序号No.08/048,164的部分后续申请。

                      1.引言

本发明涉及以显著高的亲和力和可逆方式与非水溶性形式的，包括结晶体形式的纤维素和壳多糖结合的纤维素结合区域(CBD)。已分离了本发明的CBD。本发明的CBD基本上不含天然与之联系的其他蛋白质，并发现其可用于将多种物质，特别是生物学活性分子以生物法固定于纤维素上。还公开了包括CBD和第二种感兴趣的蛋白质的融合产物，包括其制剂在多种方法中的应用。这些融合蛋白质具有包括应用于分离、纯化及诊断方法的多种有益应用。

                  2.发明的背景

                2.1.蛋白质的固定化

包括生物学活性蛋白质在内的化学物质的固定化在工业生产上是十分重要的。近年来已发展了多种固相化方法。然而，其中大多数方法都需要对固定基质进行修饰。一般说来，这些修饰都需要将配体共价结合到基质上，如此在许多情况下导致配体活性的丢失，以及掺杂某些必须事先除掉后方将基质用于药品或食品加工中的有毒有机化合物。广泛使用的产品的一个典型例子是蛋白A-Sepharose。这种十分昂贵的产品可以亲合层析法纯化IgG，以及用于诊断方法。

使用那些含有功能性区域(催化或其他功能)连同结合区域的嵌合蛋白质是相对新的技术，但已证实作为蛋白质纯化方法是特别有用的。例如，设计谷胱甘肽S-转移酶基因融合系统以表达融合到谷胱甘肽S-转移酶之C末端上的有用基因。该重组蛋白质是使用谷胱甘肽-Sepharose柱以亲和层析法纯化的。

具有功能区域和结合区域的嵌合蛋白质的另一个例子是蛋白A基因融合载体，可使用该融合载体在大肠杆菌和金黄色葡萄球菌细胞中高水平表达融合蛋白质(B.Nilsson，et al.(1985)EMBO J.4(4)：1075-1080)。蛋白A的IgG结合区域提供了一种使用IgG-Sepharose柱迅速纯化融合蛋白质的方法。已发展基于在IPTG-Sepharose或金属螯合层析柱上纯化的β-半乳糖苷酶融合蛋白质的或使用Ni-树脂柱纯化的组氨酸六聚体蛋白质的相似系统。所有这些方法都要使用很贵的基质，如Sepharose、丙烯酸树脂小珠或玻璃珠，这些基质都需要进行高成本的化学修饰并且在许多情况下还要使用高毒性化合物。另一方面，纤维素则具有极好的物理性质并且价格便宜，因而为蛋白质固定化提供了一种很大应用前途的固定基质。

                   2.2.纤维素

纤维素很适于用来固定一种用于处理果酒和果汁的酶，即内切-β-糖苷酶(Shoseyov et al.，J.Agric.Food Chem.38：1387-1390(1990))。但固定化时需要对纤维素进行化学修饰，并产生一种松软易压碎的，并且不适于装柱应用的材料。

可以在没有借助化学修饰的情况下结合上某种配体的(即“生物固定化的”)纤维素，应具有某些优点，特别是所得到的固相基质是天然的而且是无毒性的(没有进行“弄脏的化学修饰”)。其他优点可能包括所得到的固相基质保留了它的物理性质，以及其相对低的价格。目前，纤维素价格比谷胱甘肽-Sepharose和IPTG-Sepharose低100-500倍，使得纤维素成为一种可以在食品和医药工业中安全使用的，具有吸引力的、低花费的基质材料。最近，Greenwood等人(FEBS Lett.224(1)：127-131(1989))将粪纤维单孢(Cellulomonas fimi)内切糖苷酶的纤维素结合区域融合到碱性磷酸酶上。重组融合蛋白质保留了其磷酸酶活性和与纤维素结合的能力(另外参见Kilburn等人的美国专利No.5,137,819)。

但令人遗憾的是，粪纤维单孢(Cellulomonas fimi)纤维素结合区域对纤维素只表现有相对低的亲和力。例如，用加在0.5M NaCl中的50mM Tris-HCl(pH7.5)将洗掉30％以上的融合蛋白质。粪纤维单孢(C.fimi)纤维素结合区域的第二个缺点是在纤维素纤维在结合到C.fimi结合区域上之后受到破坏(Din et al.，Bio/Technology 9：1096-1098(1991))。因此，即使C.fimi纤维素结合区域可能没有表现出直接的纤维素酶活性，但对纤维素底物纤维的这种破坏作用(其相当于固相基质形态学的物理改变)同样是有问题和不期望有的(参见下文第7.3节的讨论)。