[发明专利]腮腺炎病毒的重组抗原及其在疫苗中的用途

说明书

腮腺炎病毒属于副粘病毒亚纲(subclass paramyxovirus)中的副粘病毒(paramyxoviridae)。它是引起包括腮腺炎的接触传染性婴儿病的病原体。在感染后的潜伏期间，病毒在呼吸道上皮复制再扩散到腮腺的分泌管道。随后其它腺体也可能被感染。已报道了大量脑膜炎的病例。在与感染相关的并发症中，脑炎较为严重，死亡率约为1％；聋症的病例也有报道。

可以使用抗腮腺炎病毒的疫苗：它是由培养被感染的鸡胚细胞而产生的减毒活病毒制成。在接种过的个体中此疫苗会导致血清转化，它在超过95％的血清阴性个体中可产生抗感染保护。因而此疫苗可显著降低并发症的频率。

然而，在一些病例中，由于病毒感染效果保持为亚临床状态以致难以被检测到。儿童和老人最有可能由腮腺炎病毒感染发展为并发症。由于与使用减毒活疫苗相关的固有危险性，如已接种的个体自然病原体再次感染从而加重病情，因此需要改善疫苗的安全性，尤其是对于有被感染危险的群体而言。

本发明通过提供在宿主细胞，尤其是真核细胞中产生重组腮腺炎病毒蛋白质，尤其是F、HN和NP蛋白质以及衍生于它们的融合蛋白质的系统来提出此问题。本发明也涉及构建所说蛋白质的方法，其中所使用的中间体以及可得自此中间体的重组蛋白质。在本发明特别的实施方案中，腮腺炎病毒NP蛋白质也可在细菌中表达。本发明的重组蛋白质对于开发防治腮腺炎病毒感染的亚单位疫苗有潜在的用途。

腮腺炎病毒的融合蛋白质F含有538个氨基酸残基；氨基酸1至26与信号肽相对应，残基483至512与膜锚着区域相对应。此分子上存在有7个糖基化的潜在位点。F蛋白质以65-74KDa前体(F₀)的形式合成，又经过蛋白酶水解成熟以产生由二硫键相连接的亚单位F₁(58-61FDa)和F₂(10-16KDa)。蛋白质F参与了病毒感染过程中的细胞融合，它具有溶血素活性，对于病毒穿透细胞起到一定作用。然而它不携有依赖于抗体的细胞毒性(ADCC)，而在另一种腮腺炎病毒的糖蛋白HN中却可观察到ADCC(见下文)。

蛋白质HN(分子量为74-80KDa)携有血凝素和神经氨酸苷酶活性，它们参与病毒对细胞的吸附以及对宿主细胞膜的破坏。蛋白质HN(‘吸附蛋白质’或血凝素-神经氨酸苷酶)产生中和抗体，可能对ADCC的产生很重要。蛋白质HN由582个氨基酸组成；它携有一个N-末端锚着区域(残基33至52)以及9个潜在的糖基化位点。

核衣壳蛋白NP与病毒RNA相联并参与其转录过程。以流感病毒类推，腮腺炎病毒的NP蛋白对细胞免疫的产生可能是重要的。NP蛋白由553个氨基酸组成，其分子量为72KDa并且是磷酸化的。

本发明提供了重组DNA，它编码选自下组的腮腺炎病毒抗原：

(a)具有信号肽(s)和膜锚着区域(a)的全长融合蛋白(F)(本文称作Fs+a+)；全长吸附蛋白质或血凝素-神经氨酸苷酶(HN)；全长核衣壳蛋白质(NP)；

(b)缺乏膜锚着区域的截短融合蛋白(本文称作Fs+a-)；和

(c)由F、HN和/或NP蛋白或其部分相融合而得到的杂合蛋白。

本发明特别的实施方案中，编码杂合蛋白的DNA编码：

(i)与融合蛋白信号区域相融合的缺乏5′膜锚着区域的吸附蛋白；(本文称作s+FHNa-)；或

(ii)本文称作s+FHNa-xFa-的杂合蛋白；或

(iii)与缺乏5′膜区域的吸附蛋白相融合的缺乏3′膜锚着区域的融合蛋白(本文称作Fs+a-xHNa-)。

根据本发明的重组DNA优选为一载体，最好为一表达载体，它应适于转染或转化适当宿主以致可得到大量由本发明DNA编码的蛋白质。

根据本发明的重组载体一方面可以是牛痘苗转移载体，例如下文所述的衍生于pULB5212的载体。

此类特殊载体在本文中被称作pNIV3205，pNIV3208、pNIV3213和pNIV3232。

根据本发明的重组载体另一方面可以是适于转染哺乳动物细胞，尤其是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的载体。

此类载体最好为衍生于谷氨酰胺合成酶载体，例如下文所述的已知为pEE14的载体。根据本发明的特殊载体是pEE14s+FHNa-。

根据本发明的重组载体另一方面可以是适于转化细菌细胞(如大肠杆菌)的载体。

例如，适当的此类载体可衍生于熟知的载体pUC19。

本发明另一方面提供了被根据本发明的载体转化或转染的宿主。宿主适于从牛痘苗病毒；哺乳动物细胞或细菌细胞中选择。