[发明专利]羧酸与叔醇的酯化方法

说明书

本发明涉及使用脂肪酶酶促制备羧酸酯的方法。

已知(例如从WO-A-8802775.(NOVO Industri A/s)中已知)在酯水解、酯合成和酯交换(酸解、醇解、酯交换)反应中使用脂肪酶，但所有这些反应都局限于利用伯醇和仲醇。

法国专利说明书FR-A-2,617,501(Soc.Nat.Elf Aquitaine)中甚至提出以类似叔丁醇或叔戊醇的叔醇作为溶剂，在其中进行酶促反应，这表明预期此溶剂和待用酶处理的底物之间不发生任何反应。S.Okumura等人在Biochim.Biophys.Acta 575，156-165(1979)中以实验证实了此观点，并在其中研究了经微生物脂肪酶的酯合成。黑色曲霉(Aspergillus niger)、德列马根霉(Rhizopus delemar)、白地霉(Geotrichum Candidum)或圆弧青霉(Penicillum cyclopium)的脂肪酶中无一能合成叔醇、酚或糖醇的酯类(参见表I)。

A.Zaks和A.M.Klibanov发现猪胰脂肪酶在99％的有机介质中可催化三丁酸甘油酯和多种伯醇或仲醇之间的醇解反应(Science224(15 June 1984)1249-1251)。已发现在叔醇的醇解反应中，干的脂肪酶完全没有活性，但是表I中已显示经湿的猪胰脂肪酶(酶中有占重量3.6％的水)催化的三丁酸甘油酯和叔丁醇之间醇解反应的初速度是每100mg脂肪酶22μmol/h，然而表I中未显示出产物的任何产量。最后I.L.Gatfield描述了(Lebensm.-Wiss.u.-Technol.19(1986)87-88)在米赫毛霉(Mucor miehei)(ex Rapi-dase，Seclin，France)脂肪酶的影响下，在非水非均相系统中酯的酶促合成。已发现伯和仲脂防醇可有效酯化，而叔醇却不行。表1中叔丁醇显示出与油酸(酸和醇摩尔数相等；使用3wt％的米赫毛霉酶；在室温下在密闭容器中磁力搅拌3天)之间酯化反应的程度为14％。本申请的申请人重复了此实验却未生成任何油酸叔丁基酯，然而可假定测出的14％的酯化反应程度实际上与叔丁醇中存在的杂质(特别是仲丁醇)相关，因为所使用的检测技术是基于滴定，它不能把各个酯类区分开来。

这篇文章中缺少的任何酸值和酯化值不允许任何进一步的推断，但在他们的德国专利申请DE-A-3,108,927(此文章中提及)中，发明人从酸值和酯化值中计算出了转化水平，这在此类反应中是很平常的，但尽管在此专利申请中也使用了米赫毛霉脂肪酶(酯酶30,000；商标，ex Rapidase，Seclin，France)，可此发明清楚地局限于伯醇和仲醇，它清楚地声明在此酶促反应中叔醇无反应性。

因此直至现在人们仍认为在从醇和酸酶促合成酯的过程中，不可能合成其醇部分在酯键周围有立体位阻的酯，即衍生于叔醇的酯。然而这种酶促酯合成的可用性是有价值的，特别是在“化学纯的”酯的合成中，其中不存在任何痕量的催化剂或副产物，也没有形成颜色的危险。

本发明提供了这种制备有立体位阻的酯类的酶促方法。已发现某些脂肪酶，即那些对其醇部分在酯键周围有立体位阻的酯具有水解活性的脂肪酶，能够利用醇和酸组分来制备这种酯。

因此，本发明涉及使用脂肪酶在低水状态下酶促制备羧酸酯的方法，它事实上有如下特征：使用脂肪酶来制备其醇部分在酯键周围有立体位阻的酯类，此脂肪酶选自对相同酯类具有水解活性的脂肪酶种。优选的脂肪酶是南极洲假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶A。已知南极洲假丝酵母脂肪酶  含有两种组分：脂肪酶A和B，它们可通过例如凝胶过滤从脂肪酶中产生。也可通过重组DNA技术制备它们。脂肪酶A比脂肪酶B具有更好的热稳定性，但是已发现脂肪酶B不能合成本发明的有立体位阻的酯类。也可使用就叔醇酯来说底物活性类似于南极洲假丝酵母脂肪酶A的脂肪酶种。

使用发明所用特定脂肪酶的突变体和变异体也被认为在本发明的范围之内。已发现适用于本发明的其它脂肪酶是来自皱摺假丝酵母(Candida rugosa)、白地霉和Candida cylindracae的脂肪酶。

优选地，根据本发明所使用的特定脂肪酶可通过本来已知的任何方法，例如K.Mosbach(编辑)在Methods in Enzymology.Volume44，“Immobilized enzymes”.Academic Press.New York，1976中描述的方法固定到不溶性的无机或有机载体上。