[发明专利]一种利用微生物双转化株制备二羟乙酸/氨甲基膦酸混合物改进方法

说明书

发明背景

1.发明涉及的领域

该发明是关于改进二羟乙酸与氨甲基膦酸混合物的生产工艺，改进后是将二羟乙酸与氧在氨甲基膦酸和催化剂存在的条件下，在水溶液中进行反应。更具体地说，不过不限于此，该发明是关于基因工程得到的微生物双转化株的应用，该转化株表达两个外源酶作催化剂，一个是羟基乙酸氧化酶(例如，(S)-2-羟-酸氧化酶，EC1.1.3.15)；另一个是不被AMPA(氨甲基膦酸)抑制的过氧化氢酶(例如，EC1.11.1.6)，例如来源于啤酒酵母的过氧化氢酶T。

2.有关工艺的描述

羟基乙酸氧化酶一般存在于绿叶植物和哺乳类细胞中，它催化羟基乙酸氧化生成二羟乙酸，伴随过氧化氢产生：N.E.Tolbert等(J.Biol.Chem.，Vol.181，905～914，1949)首先报道，自烟叶中提取的一种酶，催化羟乙酸氧化成甲酸和二氧化碳的反应，该反应的中间产物是二羟乙酸。加入某些化合物，如乙二胺，可限制二羟乙酸的进一步氧化。氧化反应发生在pH8左右，羟乙酸的典型浓度约为3～40mM(毫克分子)。报道的羟基乙酸氧化的最佳pH值是8.9。据报道草酸(100mM)可阻止羟基乙酸氧化酶的催化作用。K.E.Richardson和N.E.Tolbert(J.Biol.Chem.，Vol.236，1280～1284，1961)有相似的报道，含有三羟甲基氨基乙烷(TRIS)的缓冲溶液，在羟基乙酸氧化酶催化羟乙酸氧化过程中，抑制草酸的形成。C.O.Clagett，N.E.Tolbert和R.H.Burris(J.Biol.Chem.，Vol.178，977～987，1949)报道，对于羟基乙酸氧化酶催化的羟基乙酸与氧的氧化反应，最佳pH值是7.8～8.6，最佳温度是35～40℃。

I.Zelitch和S.Ochoa(J.Biol.Chem.，Vol.201，707～718，1953)和J.C.Robinson等(J.Biol.Chem.，Vol.237，2001～2009，1962)报道，在菠菜羟基乙酸氧化酶催化作用下，羟基乙酸氧化产生甲酸和CO₂，这是由H₂O₂同二羟乙酸的非酶催化反应引起的。他们发现加入催化过氧化氢分解的过氧化氢酶，能够通过抑制甲酸和二氧化碳的形成极大地提高二羟乙酸产率。加入FMN(黄素单核苷酸)大大地增加了羟基乙酸氧化酶的稳定性。

N.A.Frigerio和H.A.Harbury(J.Biol.Chem.，Vol.231，135～157，1958)已经报道了自菠菜中分离得到的羟基乙酸氧化酶的制备和性质。纯化的该酶在溶液中很不稳定，这种不稳定性归因于，FMN(黄素单核苷酸)与其活性位点的结合比较弱，另一方面是该酶具有酶活性的四聚体和八聚体解聚成无酶活性的单体和二聚体。这些单体和二聚体发生不可逆的聚集和沉淀。向酶溶液中加入FMN(黄素单核苷酸)，可大大提高其稳定性。高蛋白质浓度和高离子强度，可维持该酶以四聚体和八聚体的形式存在。

美国专利5,135,860(U.S.Patent 5,135,860)已描述了一种二羟乙酸和氨甲基膦酸(AMPA)混合物的制备方法。羟乙酸和氧在水溶液中反应，该反应是有AMPA(氨甲基膦酸)和两种酶催化剂存在条件下进行的，其一是可溶性的菠菜羟基乙酸氧化酶，另一个是可溶性过氧化氢酶(例如黑曲霉过氧化氢酶)。这个方法证明使用过氧化氢酶(以破坏副产物过氧化氢，它引起甲酸的生成)以及作为胺添加剂的AMPA，能够同二羟乙酸形成抗氧化的N-取代半缩胺和/或亚胺(限制其进一步氧化)。美国专利(U.S.Patent5,180,846)描述了这些混合物氢化，生成N-(甲基膦酰)甘氨酸的方法，这是一种苗期植物毒性剂和除草剂。本发明是对上述制备过程的特别的改进。

发明概述