[发明专利]血液中与免疫亲和素结合的药物浓度的测定方法及试剂盒

说明书

本发明是关于在特异性结合蛋白存在的情况下用于测定未经萃取的血液中药物含量的测定方法和测定试剂盒。该测定方法尤其适合于测定与免疫亲和素结合药物(如环孢多肽素、纳巴霉素类或FK 506类化合物)的血中浓度。

环孢多肽类包括一类结构上不同的环状聚N-甲基化的十一肽，它们通常具有免疫抑制作用、抗炎作用、抗病毒作用和/或抗寄生虫作用，其作用较大或较小。第一个被鉴定的环孢多肽类药物是真菌代谢产物环孢多肽A(或称为Ciclosporin)，其结构已在默克公司索引(Merck Index，第11版，默克公司，Rahway，新泽西，美国，1989)中在编号(listing)2759下给出。后来被鉴定的环孢多肽有环孢多肽B、C、D和G，它们也列在Merck Index 2759中。大量合成的类似物也是已知的，具有代表性的实例已在EP 296123，EP 484281和GB 2222770中公开。

纳巴霉素是由吸水链霉菌产生的大环内酯免疫抑制剂，已发现它在药学上有许多用途，尤其可作为免疫抑制剂，用于治疗和预防器官移植排斥反应和自身免疫性疾病。纳巴霉素的结构见Kesseler，H.，等1993；Helv.Chim.Acta；76：117。已合成了大量的纳巴霉素的衍生物，包括例如某些酰基和氨酰基-纳巴霉素(见美国专利4316885、4650803和5151413)、27-脱甲基-纳巴霉素(见WO 92/14737)、26-二氢-纳巴霉素(见美国专利5138051)、某些吡唑类衍生物(见美国专利5164399)、某些烷氧基酯衍生物(见美国专利5233036)和40-氧-烷基化的衍生物(WO 94/09010)。纳巴霉素及其结构类似物和衍生物在本申请说明书中总起来称为“纳巴霉素类”。

FK 506是由津岛链霉菌No 9993产生的大环内酯免疫抑制剂。FK 506的结构见Merck Index的附录A5。保留有FK 506的基本结构和免疫学性质的大量有相关化合物也是已知的。这些化合物在许多专利(例如EP 184162、EP 315973、EP 323042、EP 423714、EO 427680、EP 465426、EP 474126、WO 91/13889、WO 91/19495、EP 484936、EP532088、EP 532089、WO 93/5059等)中已经公开。这些化合物在本申请说明书中总起来称为“FK 506类化合物”

由于它们十分有用的药学特性，因此环孢多肽类(尤其是环孢多肽A和G)、纳巴霉素类和FK 506类化合物广泛地用于例如防止移植排斥反应和治疗自身免疫疾病。但是，在较大剂量下这些化合物有副作用，因此它们在血液中的浓度必须保持在某一治疗的范围内。由于生物利用度和代谢转化速率对各个患者是特有的，所以给药剂量对各个患者也应是特定的。因此每隔一定间隔监测上述免疫抑制剂在血液中的浓度是必须的。

虽然以高压液相色谱法(HPLC)为基础的某些测定方法已经被建立，但是都存在应用麻烦，或者没有足够专一性的缺点。对于环孢多肽和FK-506，已经制备出其特异性单克隆抗体，并已建立了以该抗体为基础的测定方法。但是，至今提供的所有这些测定方法均需要首先对血液或血浆样品用溶剂(如甲醇)进行萃取，然后用蒸发或稀释法将溶剂除去。最后才能将抗体加到样品中进行放射免疫测定(RIA)。虽然这种以特异性单克隆抗体为基础的测定方法证明是很好的，但是它需要萃取步骤，下一步又要除去溶剂，如果不小心的话，将会导致测定变得不敏感和不精确。因此，该测定方法必须由熟练的技术人员操作，并且该方法很耗费时间。

鉴于环孢多肽、纳巴霉素和FK 506类化合物作为药物应用的重要性，因此需要建立一种简单的、灵敏的检测方法，用于测定它们在血液中的浓度。

因此，本发明提供了一种检测血液中与免疫亲和素结合的药物浓度的测定方法，该方法包括：加入结合竞争剂，从血液中的免疫抑制剂-免疫亲和素复合物中置换出该药物；再加入一个能与该药物结合但与结合竞争剂不明显结合的受体；然后从样品中分离出受体-药物复合物；测定该药物的置。