[发明专利]对过氧化氢稳定的过氧化物酶变体

说明书

本发明涉及一种新的过氧化物酶变体，和含有这种过氧化物酶变体的漂白或洗涤剂组合物。

在洗涤过程中使用漂白剂并作为洗涤剂组合物的成分是本领域中熟知的。因此，在市售的大部分洗涤剂组合物中掺有漂白剂或作为其成分出售。掺入洗涤剂组合物中的重要常规漂白剂是那些在洗涤过程中形成过氧化氢的作为其前体的化合物。用作漂白剂并以此方式起漂白作用的化合物，最重要的例子是过硼酸盐和过碳酸盐。现在还不知道用这些漂白剂漂白的详细机制，但一般认为在洗涤过程中形成的过氧化氢通过氧化将有色物质(由其在织物上形成污渍)转化为无色物质，有色物质与过硼酸盐或过碳酸盐直接作用也发生一些氧化。

现已发现以过氧化氢为底物的过氧化物酶能够增强洗涤过程中过氧化氢的漂白效果。WO89/09813中描述了过氧化物酶漂白织物上污渍的应用。还发现从染色织物上沥出的有色物质可借助过氧化物酶和过氧化氢一起漂白。WO91/05839中描述了过氧化物酶以此方式抑制染料转移的应用。

现令人惊异地发现，可通过重组DNA技术制备在碱性条件下提高了对过氧化氢稳定性的过氧化物酶变体。

因此，本发明涉及在碱性条件下提高了对过氧化氢稳定性的过氧化物酶变体，其特征在于在SEQ ID.1中所示序列编码的灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)过氧化物酶这一亲本过氧化物酶的48-56，76，109，214，239，258-262，264，266-272氨基酸残基区中插入、缺失或取代一个或多个氨基酸残基。

经X线衍射获得亲本过氧化物酶结晶结构的信息，还通过亲本过氧化物酶的氨基酸序列与其他已知过氧化物酶的氨基酸序列排列比较来获得这些信息(K.G.Welinder等，″Structure and evolutionof peroxidases″in Plant Peroxidase Biochemistry and Physiology，K.G.Welinder等(编)，University of Copenhagen and Geneva1993)。

在本文中术语“提高了对过氧化氢的稳定性”意指在高达20mMH₂O₂浓度的过氧化氢存在下过氧化物酶变体稳定性至少比亲本过氧化物酶的高10％。更具体讲，这是指在10-60℃温度范围内一个或多个温度下、在最高达20mM H₂O₂的一个或多个H₂O₂浓度下，过氧化物酶变体的半衰期比野生型过氧化物酶(亲本过氧化物酶)的至少长10％。(通过将残余活性与一级衰变相匹配来测定半衰期)。术语“碱性条件”指7-11的PH范围。

另一方面，本发明涉及含有本发明过氧化物酶变体和过氧化氢源，任选还含有可氧化底物的漂白组合物；涉及含有表面活性剂、本发明的过氧化物酶变体，过氧化氢源、任选还含有可氧化底物的洗涤剂组合物。

参照附图进一步说明本发明，其中

图1表示质粒pHD414，它是质粒p775(在EP238023中有述)的衍生体。按实施例1获得质粒pHD414。

在本说明书和权利要求中使用了下列缩写：氨基酸：A＝Ala＝丙氨酸V＝Val＝缬氨酸L＝Leu＝亮氨酸I＝Ile＝异亮氨酸P＝Pro＝脯氨酸F＝Phe＝苯丙氨酸W＝Trp＝色氨酸M＝Met＝蛋氨酸G＝Gly＝甘氨酸S＝Ser＝丝氨酸T＝Thr＝苏氨酸C＝Cys＝半胱氨酸Y＝Tyr＝酪氨酸N＝Asn＝天冬酰胺Q＝Gln＝谷氨酰胺D＝Asp＝天冬氨酸E＝Glu＝谷氨酸K＝Lys＝赖氨酸R＝Arg＝精氨酸H＝His＝组氨酸

在描述本发明过氧化物酶变体过程中，为了指称方便使用了下列命名原则：原始氨基酸：位置：取代后的氨基酸

根据这一命名原则，例如在48位由丝氨酸取代赖氨酸表示如下：K48S；在此位缺失赖氨酸表示为：K48^*；插入另外的氨基酸残基如酪氨酸则表示为：K48KY。多个取代用加号隔开，即：E214L＋E239L代表在214和239位由亮氨酸取代谷氨酸的突变。

亲本过氧化物酶由SEQ ID No.1中所示氨基酸序列编码。所述序列可从灰盖鬼伞衍化而来。

在本发明过氧化物酶变体的一种实施方案中，在SEQ ID No.1中所示氨基酸序列编码的亲本过氧化物酶48-56，76，109，214，239，258-262，264，266-272氨基酸残基区中缺失、插入或取代一个或多个氨基酸残基。