[发明专利]来自被真菌感染的藻类的α-1，4-葡聚糖裂解酶，其纯化，基因克隆和在微生物中的表达

说明书

本发明涉及一种酶，特别是α-1，4-葡聚糖裂解酶(“GL”)。本发明还涉及提取该酶的方法。本发明还涉及编码该酶的核苷酸序列。

FR-A-2617502和Baute等在Phytochemistry[1988]Vol.27No.11 pp3401-3403中报道了以明显的酶促反应在普通羊肚菌(Morchella vulgaris)中生产1，5-D-脱水果糖(“AF”)。AF的产量相当低。尽管提及了可能的酶促反应，但这两份文献都没有提供任何酶的任何氨基酸序列资料，更不用说任何核苷酸序列资料。这些文献说到AF可作为制备抗生素羟基羟甲基吡喃酮的前体。

Yu等在Biochimica et Biophysica Acta[1993]Vol.1156 pp313-320中报道了从红海藻中制备GL和其降解α-1，4-葡聚糖以生产AF的用途。AF的产量相当低。尽管该文献提及了GL酶，但未提供该酶的任何氨基酸序列，更不用说编码该酶的任何核苷酸序列资料。该文献还建议GL的来源就是藻类。

根据本发明，提供了一种制备α-1，4-葡聚糖裂解酶的方法，它包含从被真菌感染的藻类分离该酶。

优选使用不含被该酶降解的凝胶分离和/或进一步纯化该酶。

优选凝胶以糊精为基础，优选β-环糊精或其衍生物，优选环糊精，更优选β-环糊精。

根据本发明，还提供了一种以本发明的方法制备的GL酶。

优选该酶包含氨基酸序列SEQ.ID.No.1或SEQ.ID.No.2，或其任意变异体。

术语“其任意变异体”指在使所得的酶具有裂解酶活性的前提下对该序列的至少一个氨基酸的任意取代，改变，修饰，置换，缺失或增加。

根据本发明，还提供了编码α-1，4-葡聚糖裂解酶的核苷酸序列，优选其中的序列不存在于其天然环境中(即不构成表达该酶的细胞生物体天然基因组的一部分)。

优选的核苷酸序列是DNA序列。

优选的DNA序列包含与SEQ.ID.No.3或SEQ.ID.No.4中任意一个相同，或互补，或基本上同源或含任意合适的密码子取代的序列。

“基本上同源”的表达包含有关结构和/或核苷酸成份和/或生物活性的同源性。

“含任意合适的密码子取代”的表达包含用另一编码相同氨基酸的密码子进行的任何密码子置换或取代或在使所得的酶具有裂解酶活性的前提下对其进行的任何增加或删除。

换句话来说，本发明也包含修饰的DNA序列，其中至少一个核苷酸已缺失，取代或修饰，或者其中至少插入了一个额外的核苷酸以编码具有葡聚糖裂解酶活性的多肽，优选酶具有增强的裂解酶活性的酶。

根据本发明，还提供了制备α-1，4-葡聚糖裂解酶的方法，包含表达本发明的核苷酸序列。

根据本发明，还提供了使用β-环糊精来纯化酶，优选GL。

根据本发明还提供了一种核苷酸序列，其中的DNA序列包含与SEQ.ID.No.3或SEQ.ID.No.4中任意一个相同，或互补，或基本上同源，或含任意合适的密码子取代的序列，优选其中的序列是一种分离的形式。

本发明的一个关键的方面在于认识到了GL来自被真菌感染的藻类。这是首次测定了GL的氨基酸序列并确定了编码GL的核酸序列。因此，本发明的一个关键的优势是现在可用诸如重组DNA技术大量制备GL，从而使诸如抗生素羟基羟甲基吡喃酮的化合物能较容易地大量制备。

优选分泌该酶以简便其纯化。为做到这一点，将编码成熟酶的DNA与选定宿主的信号序列，启动子和终止子融合。

为了在黑色曲霉(Aspergillus niger)中表达，将gpdA(来自构巢曲霉(Aspergillus nidulans)甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因)启动子和信号序列与编码成熟裂解酶的DNA(例如SEQ.I.D.No.3或SEQ.ID.No.4)的5′端融合。将黑色曲霉trpC基因的终止子序列置于该基因的3′端(Punt.P.J.et al(1991)：J.Biotech.17，19-34)。将该构建体插入含E.coli复制起点和选择起点及黑曲霉(A.niger)选择标记的载体中。黑曲霉选择标记的例子是用于选择转化子的amdS基因，argB基因，pyrG基因，hygB基因，BmlR基因。可将该质粒转化黑色曲霉并可从转化子培养基中回收成熟的裂解酶。

可将构建体转化进蛋白酶缺陷型菌株中以减少培养基中对裂解酶的蛋白裂解性降解(Archer D.B.et al(1992)：Biotechnol.Lett.14，357-362)。