[发明专利]臭曲霉表达系统

说明书

本发明领域

本发明涉及在重组蛋白质生产中有用的宿主细胞。具体地说，本发明涉及曲霉属的真菌宿主细胞，可以用其高水平表达重组蛋白质，特别是酶。

本发明背景

近年来，重组宿主细胞在异源蛋白质表达中的使用已经大大简化了有商业价值蛋白质的大量生产，当然，从其天然来源仅仅通过纯化也是可以得到的。最近，选择了许多表达系统用于从中生产任何给定的蛋白质，其中包括原核和真核宿主。适宜表达系统的选择常常不仅取决于宿主细胞以活性状态生产相当产率的蛋白质的能力，而且在大程度上受蛋白质的最终用途所支配。

尽管常常用哺乳动物和酵母细胞作为真核宿主，但是已现在开始认识到用丝状真菌作为重组蛋白质生产的宿主细胞是非常有用的。目前用于或建议用于所述目的的丝状真菌是粗糙链孢霉，Acremonium chrysogenum，Tolypocladium geodes，卷枝毛霉和Trichoderma reesei。另外，已经特别有效地用曲霉属的某些种作为重组蛋白质生产的宿主细胞。曲霉属是半知菌类真菌，其特征在于aspergillum由终止于泡囊的分生孢子菌柄组成，每个菌柄依次带有一或两层同时形成的特化细胞，称为小梗或瓶梗，以及无性形成的孢子，称为分生孢子。已经报道了用重组质粒转化构巢曲霉(Ballance et al.Biochem.Biophys.Res.Comm.112：284-289，1983)，但发现转化的的频率相当低。已经描述了将黑曲霉和米曲霉用于重组生产蛋白质。但是，尚未表明将曲霉属的其他种可用于蛋白质的重组生产，而且事实上，由于蛋白酶或真菌毒素的低表达和/或过量生产，并不是曲霉属的所有种均适于作为宿主细胞用于该目的，而且从一个种的这种能力也不能推测到另一个种。已经用臭曲霉表达乙型肝炎抗原(Hongdi，et al ActaMicrobiologica Sinica 30：98-104，1990)，但是还没有报道将其用于表达任何其他类型的蛋白质，而且也没有报道说它可以以高产率生产蛋白质。一种理想的表达系统是基本上没有蛋白酶和真菌毒素产生且无大量内生分泌的蛋白质，但是比已知宿主细胞的表达水平高。现在本发明提供符合这些要求的新的曲霉表达系统。

本发明综述

本发明提供含有编码异源酶的核酸序列的臭曲霉宿主细胞。“异源酶”指不是宿主细胞中天然存在的，或已经对其进行了修饰从而改变了天然序列的天然蛋白质。在优选的实施方案中，所述蛋白质是异源真菌酶。所述核酸序列与一适宜的启动子可操作相连，所述启动子能够指导核酸序列在所选宿主细胞中的转录。

本发明涉及重组生产酶的方法，所述方法包括在导致表达所述酶的条件下，培养含有编码异源酶的核酸序列的臭曲霉，然后从培养物中回收所述酶。在优选的实施方案中，所述酶是真菌酶。

本发明的宿主细胞和方法在各种真菌酶的重组生产中与其他已知的曲霉种例如黑曲霉或米曲霉相比，有意想不到的效果。本发明的详细描述

臭曲霉属于曲霉属的Nigri组。Nigri组的成员，例如黑曲霉是特征在于有辐射状的分生孢子头和呈黑色的分生孢子群；球形泡囊；菌柄光滑透明，或在泡囊下有色素；有或没有梗基，且常常着色(“The Genus Aspergillus”，by K.B.Raper and D.I.Fennel，TheWilliams and Wikins Company，Baltimore，1965)。这些菌株的突变体在孢子颜色和纹饰上不同，或在该组内也包括其他微生物学特征。在曲霉属的Nigri组内，分类单位的界定经过了多论，这是因为主要分类目录所主要依赖的菌落颜色和产分生孢子结构有变异(即，Raper and Fennel，同上文)。Raper和Fennel鉴定的臭曲霉-相关的分类单位是臭曲霉和臭曲霉acidus变种和臭曲霉pallidus变种。