[发明专利]用微生物转化体制备的乙醛酸和氨甲基膦酸混合物

说明书

                       发明背景

1.发明领域：

本发明涉及一种生产乙醛酸和氨甲基膦酸(AMPA)混合物的方法，其中，在存在AMPA和催化剂的情况下，乙醇酸和氧在水溶液中发生反应，其中的催化剂是由表达菠菜中乙醇酸氧化酶((S)-2-羟酸氧化酶，EC1.1.3.15)和表达过氧化氢酶(EC1.11.1.6)的基因工程微生物转化体组成。此方法制备的乙醛酸和氨甲基膦酸混合物，对于生产N-(膦酰甲基)甘氨酸，一种广谱的后应急性(post-emergent)除莠剂，是有用的中间体。

2.相关技术的说明：

乙醇酸氧化酶，是一种同时存在于绿色植物叶和哺乳动物细胞中的酶，它催化乙醇酸氧化成乙醛酸，同时产生过氧化氢：

N.E图尔伯特等(生物化学杂志，Vol.181，905-914(1949))首先报导了一种从烟草叶中提取的酶，它能催化乙醇酸经过形成乙醛酸中间体氧化生成甲酸和CO₂。加入某些化合物如乙二胺，可限制中间体乙醛酸进一步氧化。典型的氧化过程可用浓度约3-40mM的乙醇酸，在pH值约8的条件下进行。有人报导乙醇酸氧化的最适pH是8-9。还有人报导，草酸(100mM)能抑制乙醇酸氧化酶的催化作用。类似的情况是，K.E.理查逊和N.E图尔伯特(生物化学杂志，Vol.236，1280-1284(1961))曾报导，含有三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)的缓冲液，可抑制在乙醇酸氧化酶催化乙醇酸氧化的过程中生成草酸。C.O.克拉盖特，N.E图尔伯特和R.H.伯立斯(生物化学杂志，Vol 178，977-987(1949))还曾报导，乙醇酸氧化酶催化用氧来氧化乙醇酸的最适pH是约7.8-8.6，最适温度是35-40℃。

I.泽立奇和S.奥赫阿(生物化学杂志，Vol 201，707-718(1953))和J.C.罗宾逊等(生物化学杂志，Vol.237，2001-2009(1962))曾报导，在菠菜乙醇酸氧化酶催化乙醇酸氧化中，甲酸和CO₂的生成是由于H₂O₂和乙醛酸的非酶促反应所致。他们观察到，加入过氧化氢酶(催化H₂O₂分解的酶)，通过抑制甲酸和CO₂生成，可大大提高乙醛酸的产率。还发现，加入FMN(黄素单核苷酸)可大大增加乙醇酸氧化酶的稳定性。

N.A.弗里格里奥和H.A.哈伯利(生物化学杂志，Vol.231，135-157(1958))已经报导了从菠菜中分离的乙醇酸氧化酶的制备方法和特性。发现这种纯化的酶在溶液中非常不稳定，这种不稳定性是由于黄素单核苷酸(FMN)对酶活性部位的结合比较弱，并且还由于具有酶活性的酶四聚体和/或八聚体解离变成无酶活性的单体和二聚体所致，这些单体和二聚体将发生不可逆的凝集和沉淀。将FMN(黄素单核苷酸)加入酶溶液会大大地增加其稳定性，并且高蛋白质浓度或高离子强度能维持酶的八聚体或四聚体的构型。

还有许多关于乙醇酸氧化酶催化氧化乙醇酸的其它参考文献。下列参考文献中描述了该酶的分离(和测定)方法：I.泽立奇，酶学方法，Vol.1，学术出版社，纽约，1955，p.528-532(从菠菜和烟草叶中)，M.Nishimura等，生物化学和生物物理丛刊，Vol.222，397-402(1983)(从西葫芦子叶中)，H阿斯卡和D.戴维斯，生物化学和生物物理学报，Vol.761，103-108(1983)(从大鼠肝中)，以及M.J.埃米斯和K.H埃里斯曼，国际生物化学杂志，Vol.16，1373-1378(1984)(从浮萍属植物中)。关于该酶的结构也有如下报导：E赛得兰德等，欧洲生物化学杂志，Vol.173，523-530(1988)和Y.林德魁斯特和C.布兰登，生物化学杂志，Vol.264，3624-3628(1989)。

                      发明概述