[发明专利]防止蛋白质C降解的方法

说明书

本发明涉及酶学，特别是涉及防止被活化的蛋白质C降解的方法。

蛋白质C是丝氨酸蛋白酶和天然存在的抗凝剂，它在调节止血中通过激活凝血级联中的因子Ⅴa和Ⅷa而发挥作用。人类蛋白质C是作为有461个氨基酸的单一多肽在体内主要在肝脏中产生的。该前体分子受到多重转译后修饰，包括1）裂解42氨基酸信号序列;2）从一链酶原上蛋白水解除去155位上的赖氨酸残基和156位上的精氨酸残基以得到二链形式的分子（即155个氨基酸残基的轻链通过二硫桥键连接到含丝氨酸蛋白酶的262个氨基酸残基的重链上）;3）群集在轻链前42个氨基酸残基中的9个谷氨酸残基经维生素K依赖性羧化作用，产生9个γ-羧基谷氨酸残基;4）在4个位点上连接糖（1个在轻链中，3个在重链中）。重链含有已明确证实的有Asp257、His  211和Ser    360三位组合的丝氨酸蛋白酶。最后，在钙离子存在下，在体内于磷脂表面由凝血酶激活循环的2链酶原。由于除去重链N末端的十二肽而导致的活化作用，产生具有酶促活性的被激活的蛋白质C（aPC）。

在用大量和高浓度aPC进行的工作中，观察到在重链308位赖氨酸处的蛋白水解剪切部分。该剪切所产生的N末端序列以Glu-Ala-Lys开始，并从重链的C末端产生称为“EAK片段”的111氨基酸片段。EAK片段没有通过二硫键共价连接到轻链上或重链上的N末端部分上。EAK片段还含有丝氨酸蛋白酶的活性位点丝氨酸，但没有Asp或His残基。因此，发现带有EAK片段的蛋白质C制剂已改变了抗凝血剂活性。本发明包括通过在变性剂中，或在极端盐浓度中于降低的pH下保存分子以防止或减少蛋白质C分子降解的方法。

为描述本发明的目的，对本文中使用的术语定义如下。

aPC-活化的人蛋白质C。

APTT-活化的部分组织促凝血酶原激酶时间。

AU-酰胺水解单位。

BME-β-巯基乙醇。

CHES-2[N-环己基氨基]乙烷磺酸。

EAK片段-在蛋白质C重链的308位剪切而产生的111氨基酸片段。

EDTA-乙二胺四乙酸。

HEPES-N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙烷磺酸。

HPC-人蛋白质C酶原。

MEA-2-氨基乙醇。

MES-2-（N-吗啉代）-乙烷磺酸。

新生蛋白质-在mRNA转录本转译后产生的，进行任何转译后修饰之前的多肽。但例如谷氨酸残基的β羧化和天冬氨酸残基的羟化等转译后修饰作用可能在从mRNA转录本完全转译成蛋白质之前开始出现。

蛋白质C活性-负责蛋白质水解、酰胺水解、酯水解和生物学（抗凝血或血纤维蛋白溶解）活性的人蛋白质C的任何性质。试验蛋白质C抗凝血和酰胺水解活性的方法是本领域中已知的（参见Grinnellet  al.，1987，Bio/Technology    5：1189-1192）。

rHPC-重组产生的人蛋白质C酶原。

酶原-蛋白水解酶的酶学无活性前体。本文所说的蛋白质C酶原是指一链或二链的，分泌的、无活性形式的蛋白质C。

本说明书中所用的所有氨基酸缩写都是如37  C.F.R.§    1.822（b）（2）（1990）中所列的被美国专利与商标局接受的氨基酸缩写词。

本发明涉及防止或最大限度减少活化的蛋白质C自发降解的方法。本发明是通过在低pH下，例如，在大约pH6.3至pH7.0条件下完成活化的蛋白质C的加工、纯化和/或储存而给出最佳实例的。也可在3M尿素中保温aPC（在除去变性剂后得以完全回收aPC活性），或在极端盐浓度的存在下保温aPC来尽可能地减少aPC的自发降解。为本公开的目的，极端盐浓度是指盐浓度在大约0.4摩尔以上或大约0.05摩尔以下。本发明也包括使aPC保持在低pH，在变性剂中，或在极端盐浓度下的aPC配制品。

蛋白质C在维持止血中的作用，已激发了对使用该化合物作为多种血管病的治疗剂的很大兴趣。在工业规模上生产高水平和高浓度的人蛋白质C已暴露出这样一个事实，即该分子可发生自发降解而导致抗凝血活性的降低。aPC的自发降解导致从重链的C末端形成一个称为“EAK片段”的111氨基酸片段。EAK片段没有通过二硫键共价连接到轻链上或重链的N末端部分上。EAK片段还包括丝氨酸蛋白酶的活性位点丝氨酸残基，但没有Asp或His残基。因此，由于存在蛋白水解修剪，带有EAK片段的蛋白质C制剂已改变了抗凝血活性。