[发明专利]用于检测DNA的特异碱基顺序的方法和装置

说明书

本发明涉及用于检测特异性DNA（脱氧核糖核酸）碱基顺序的一种方法和一种装置。这样的检测一种特异性DNA碱基顺序的操作被应用于临床试验、基因诊断、病理研究、药物质量控制及其他领域中。

特异性DNA碱基顺序主要是利用Southern blotting法和液相杂交法（Liqpid phase hybridization）来检测。然而，不利的是这样一种方法由于需要进行B-F分离和将DNA片段拼结成膜因而处理起来太复杂。作为一种无需进行B-F分离而检测一种特异碱基顺序的方法，业已推荐了一种使用一种荧光标记单链DNA探针和一种固定剂的方法，所述固定剂是通过将碱基顺序与所述DNA探针互补的单链DNA耦合到具有高分子量的载体上的方式制备的。当样品中的DNA和所述DNA探针以竞争的方式同所述固定剂反应之后，根据荧光偏光度检测所述特异碱基顺序[参见日本专利申请公开本5-123196（1993）]。

另一方面，将表面敏化的（Surface Sensitized）喇曼光谱法用作一种检测分子振动光谱的方法。这个方法利用了这样一种现象，即当一种物质被吸收在电极的表面或贵金属（例如金或银）的胶体上时引起了强的喇曼散射（例如，参见“Bunseki”1993，第577-585页）。蛋白质、胆红素及其他类似物是通过这种表面敏化的喇漫光谱法研究的。众所周知，当出现表面敏化的喇曼散射时，振动光谱就被强到10⁷至10⁸倍，这使得能够进行高灵敏度的测量。

然而，不利的是使用所述荧光标记的DNA探针和所述固定互补DNA处理起来复杂并且由于要用各种化学物质标记DNA而使其方便性差。

本发明的第一个任务是提供一种可以简化对特异碱基顺序的测量而无需用化学物质标记DNA的操作。

本发明的第二个任务是提供一种用于完成前面所述的特异碱基顺序检测的装置。

本发明的检测DNA碱基顺序的方法使用了一种DNA探针，这种探针是通过用贵金属胶体颗粒标记具有待检测的靶DNA的特征碱基顺序的特异性单链DNA来制备的，该方法包括如下步骤：一个通过升温将样品DNA分裂为单链DNA的步骤;一个在所述分裂步骤之前或之后将所述DNA探针同所述DNA样品加以混合的步骤;一个降低所述被分裂的DNA样品和所述DNA探针的混合溶液的温度以便随即使所述DNA探针和所述碱基顺序互补的被分裂的样品DNA键合的杂交步骤;以及随后测量通过用激发光照射所述混合溶液所产生的喇曼散射光的步骤。所述DNA探针是通过使所述的特异性单链DNA同金、银或铜的贵金属胶体颗粒键合的方式制备的。所述胶体颗粒的适宜的尺寸是0.8至200nm。

检测相应于所述DNA探针的碱基顺序的一种较为可取的模式包括用光谱测定法分析在杂交步骤前后由所述DNA探针所得到的喇曼散射光成分以及根据所述喇曼散射光成分的光谱的特征之间所存在的差别来检测所述碱基顺序的方法。

尽管并不排除将本发明应用于一种进行B-F分离的不同的检测方法，但是最好还是在杂交步骤后可以不进行B-F分离来检测喇曼散射光。

本发明的用于检测DNA碱基顺序的装置包括一个可以储存所述DNA样品和所述DNA探针的混合溶液的、带有一个温度传感器和加热/冷却装置的器皿、一个用于激发光照射储存在该器皿中的混合溶液的光源部分、一个用来通过光谱测定法测量由储存在所述器皿中的混合溶液发出的喇曼散射光成分的光谱测定部分以及一个用来根据预定的程序通过所述器皿中的温度传感器和加热/冷却装置改变所述器皿的温度的温度控制器。

图1A说明了一个通过将带正电荷的金胶体72混合入含具有待检测的靶DNA的特征碱基顺序的特异性单链DNA70的溶液中的方式形成DNA探针74的过程。

图1B说明了一个检测相应于形成DNA探针74的所述单链DNA的一种碱基顺序的方法。将用于测量的、含有DNA样品76的溶液引入一个受到温度控制的器皿78中并且用tris-盐酸缓冲液或磷酸缓冲液将该溶液的pH值调节到4至8.5，而后将DNA探针74与该溶液相混合。将受到温度控制的器皿78加热到温度为90-95℃，以便分裂DNA样品76并将它转化为单链DNA76a。而后，逐渐降低温度，以便在37℃至70℃下保温几分钟至一个小时。如果DNA样品76包括了相应于形成DNA探针74的单链DNA的碱基顺序，那么DNA样品76的相应的单链DNA76a与DNA探针74杂交，在DNA探针76中形成双链DNA。数字80表示带有所述双链DNA的DNA探针。